[发明专利]副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于，其试剂包括：

——引物混合液：四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4；

——Bst DNA聚合酶：浓度为8U/μl；

——反应液：10mM dNTP∶10×ThermoPol反应缓冲液∶150mM MgSO₄＝8∶5∶2； 

——样品预处理液：20mM Tris-HCl(pH 8.0)，2mM EDTA，1.2％Triton X-100；

——显色剂：荧光染料1×SYBR Green I；

——阳性对照为副溶血弧菌基因组DNA，阴性对照为不含模板的反应混合液。

2.一种用权利要求1所述的试剂盒检测副溶血弧菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)待检副溶血弧菌DNA提取过程：取过夜培养的增菌液于离心管中，1000rpm离心2分钟，去上清；加入样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；沸水中煮10分钟后立即置于冰上冷却10分钟；10000-12000rpm离心2分钟，上清即可作为待检副溶血弧菌DNA；其中增菌液与样品预处理液的用量比为5∶8；

(2)恒温基因扩增反应：在PCR管中配制反应溶液：引物混合液1.5μl，反应液5.5μl，BstDNA聚合酶0.5μl，(1)中得到的待检DNA 2μl，加水至11.5μl；设置阳性对照反应时，用副溶血弧菌基因组DNA替代(1)中得到的待检副溶血弧菌DNA，设置阴性对照反应时，用不含模板的反应混合液替代(1)中得到的待检副溶血弧菌DNA；将含有配制好的反应溶液的PCR管于65℃反应1.5小时；

(3)分析判断反应产物结果：在(2)中得到的产物中加入2.5μl显色剂，混匀，静置5min；若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。