[发明专利]一种新的重组蛇毒金属蛋白酶的表达、复性及其生物学活性

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组蛇毒金属蛋白酶基因的构建、表达以及该重组蛇 毒金属蛋白酶的体外复性和活性测定。

背景技术

蛇毒中含有很多具有生物学活性和医药及工业应用价值的蛋白酶类。其 中，蛇毒金属蛋白酶是主要组份之一。它常常是蝮蛇蛇毒的主要毒素，引起 被咬机体的局部或系统出血。由于蛇毒金属蛋白酶是一种蛋白酶，所以，与 其他工业用蛋白酶一样，它也具有潜在的和现实的医药和工业用价值。如蛇 毒降纤酶就是从蛇毒中分离得到的一种蛋白酶，目前已应用于人体血栓的临 床治疗中。此外，国外科学家试验表明，蛇毒蛋白酶还可去除衣物污渍。但 是，由于天然蛇毒的来源有限，品种资源的日益减少以及分离纯化的繁琐和 困难，因此，通过基因工程或蛋白质工程技术创造新的蛋白酶品种，以及通 过发酵大规模生产重组蛋白酶就具有特别重要的意义。

目前，通过基因工程技术在大肠杆菌中表达重组蛋白已成为分子生物学 中的常规技术。但是，很多蛋白酶，尤其是含有多个二硫键的蛋白酶在大肠 杆菌中表达后往往形成没有生物学活性的不溶性的包涵体；经体外复性后， 很多蛋白酶还是没有生物学活性。为了绕过没有生物学活性的包涵体这个难 关，人们常常利用酵母和动物细胞来生产或表达真核蛋白。但是，利用酵母 和动物细胞生产重组蛋白的成本很高，表达量相对较低，生产周期较长，分 离纯化的难度相对较大，操作技术也更复杂，不利于工业化生产。另外，有 些毒性蛋白不适合于在动物细胞中生产，而更易于在大肠杆菌中以包涵体的 形式大量表达。因此，若能使在大肠杆菌中以包涵体形式表达的重组蛋白酶 复性后仍具有较强的生物学活性，那么，在大肠杆菌中生产重组蛋白酶就具 有极大的成本优势和大规模工业应用价值。

本发明利用已公开发表的巴西非出血蛇毒金属蛋白酶成熟酶区cDNA序 列和中国皖南尖吻蝮蛇出血蛇毒金属蛋白酶acutolysin A(该酶的名称)的 成熟酶区cDNA序列为材料，构建了一种自然界不存在的重组金属蛋白酶基 因，并在大肠杆菌中高效表达了该蛋白酶。经体外复性后，该蛋白酶具有明 显的蛋白水解活性。

巴西蛇毒金属蛋白酶基因序列的参考文献：

1，Selistre de Araujo H.S.& Ownby C.L.(1995)Molecular cloning and sequence analysis of cDNAs for metalloproteinases from broad-banded copperhead Agkistrodon contortrixlaticinctus. Arch.Biochem.Biophys.320，141-148.

2，Selistre de Araujo H.S.，de Souza E.L.，Beltramini，L.M.，Ownby，C.L.& Souza，D.H.(2000) Expression，refolding，and activity of a recombinant nonhemorrhagic snake venom metalloprotease.Protein Expr.& Purif.19，41-47.

中国皖南尖吻蝮蛇出血毒金属蛋白酶acutolysin A(该酶的名称)的 成熟酶区cDNA序列参考文献：

1，Liu，Q.，Xu，W.，Cheng，X.，Jin，G.，Shen，X.，Lou，H.& Liu，J.(1999)Molecular cloning and sequence analysis of cDNA encoding hemorrhagic toxin acutolysin A from Agkistrodon acutus.Toxicon 37，1539-1548.

发明内容

为了克服上述不足之处和开发新的工业用或医药用蛋白酶，本发明构建 了一种新的重组或嵌合蛇毒金属蛋白酶基因，并在大肠杆菌中以包涵体的形 式表达了该重组金属蛋白酶，经体外复性后，该重组蛋白酶具有对多种蛋白 底物的水解活性。