[发明专利]一种重组可溶性人FGFR2胞外段及其生产方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及人FGF受体技术领域，具体地说，涉及一种重组可溶性人FGFR2胞外段及其生产方法与应用。

背景技术

成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors FGFs)是一组同源的肝素结合多肽，其家族包含23个成员。FGFs有广泛的生物学活性，例如在胚胎发育中调控细胞增殖、迁移和分化，在成体中诱导创伤修复，肿瘤生长和分化，诱导新血管生成。FGFs对于多种细胞类型来说都是有效的促有丝分裂剂。FGFs的多样的生物学活性是通过细胞表面的高亲和性受体FGFRs来实现的。

FGF以及FGFR都是重要的原癌基因，它们在肿瘤的增殖、血管生成、转移以及凋亡等的生理活动中起着非常重要的作用。因此FGFs及FGFRs已经成为一个新的抗肿瘤研究靶点。

成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptors，FGFRs)属于酪氨酸激酶受体家族，它们在特定的时间和空间表达，是FGF信号通路上重要的调控点之一，FGFR正常功能的紊乱可导致人类疾病的发生。例如FGFR的基因突变可导致FGFR对FGFs的亲和力发生改变从而引发骨发育畸形，如软骨发育不全(achondroplasia)，肢端发育畸形如并指症(syndactyly)，颅缝早闭(craniosynostosis)等；另外FGFR的过表达或mRNA的选择性剪切的错误调控可导致细胞转型和癌化。

Apert综合征(AS)表现为颅缝早闭，严重的并指(趾)，常伴有严重的中枢神经系统畸形、智力迟钝等，几乎所有的AS都发现有FGFR2的两种突变：S252W和P253R，这两个位点在高度保守的免疫球蛋白样功能区D2-D3的连接部分，通过对FGF2和FGFR 2突变体两者复合体晶体结构的分析，发现两种突变都引起FGF2/FGFR2亲和力的增加，将两种点突变引入我们构建的FGFR2胞外段，由于增强了对FGFs的亲和力，从而大大加强对肿瘤的生长及血管形成的抑制作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成本低，复性效率高，活性好的重组可溶性人FGFR2胞外段的生产方法。

本发明的另一个目的是提供上述生产方法所得到的重组可溶性人FGFR2胞外段。

本发明的进一步目的是提供上述重组可溶性人FGFR2胞外段在制备抗肿瘤药物中的应用。

Apert Syndrome(AS)颅缝骨早闭综合症由FGFR2的两种突变导致：S252W或P253R。原因在于FGFR2的这两种突变都引起FGFR2与配体的亲和力分别增加3-10倍，我们构建野生型及双突变型的的FGFR2胞外段，在大肠杆菌表达并纯化，因为突变型与FGF-2具有高亲合力，因此细胞培养液中的绝大部分FGF-2将与突变型的FGFR2结合，从而竞争性地抑制了肿瘤细胞膜上FGFR2与配体的结合，能够强烈地抑制FGF的信号，显著抑制肿瘤细胞的增殖、转移以及血管形成。同时，由于FGF对各种肿瘤都有作用，因此突变型FGFR胞外段可广谱抑制如乳腺癌、前列腺癌、肺小细胞癌等各种肿瘤。

本发明的重组可溶性人FGFR2胞外段的生产方法，包括如下步骤：

(1)目的基因FGFR2的全基因合成；

根据截短型FGF受体野生型胞外段氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏好性原则设计四对引物，四对引物序列分别如序列表NO：1～NO：4所示，由内而外分别进行四轮重叠延伸扩增，首先是F1、R1互为模版扩增，然后以第一轮产物作为模版，F1、R1作为引物进行下一轮的扩增，如此进行4轮扩增；

(2)FGFR2双突变型的构建；

针对S252W和P253R双突变的引物称为M252+253_F和M252+253_R，序列如序列表NO：5所示；

(3)双酶切FGFR2基因与载体，连接构建重组载体，转化宿主菌，构建FGFR2基因工程菌；

(4)培养FGFR2基因工程菌，分离、清洗、溶解包涵体得到包涵体溶解液；

(5)纯化包涵体；

(6)复性；

(7)超滤、冻干得到重组可溶性人FGFR2胞外段。

在上述的生产方法中，步骤(1)所述扩增的条件是94℃，4min后，94℃，30s，64℃，30s，72℃，60s，32个循环，72℃，10min。

在上述的生产方法中，步骤(3)所述载体为pET3c，双酶切所用的酶为Nde I和BamH I，所述宿主菌为大肠杆菌。