[发明专利]一种重组可溶性人FGFR2胞外段及其生产方法与应用

权利要求书

1.一种重组可溶性人FGFR2胞外段的生产方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)目的基因截短型FGFR2的构建；

根据截短型FGFR2胞外段氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏好性原则设计四对引物，四对引物序列分别如序列表NO：1～NO：4所示，由内而外分别进行四轮重叠延伸扩增，首先是F1、R1互为模版扩增，然后以第一轮产物作为模版，F1、R1作为引物进行下一轮的扩增，如此进行4轮扩增；

(2)FGFR2双突变型的构建；

针对S252W和P253R双突变的引物称为M252+253_F和M252+253_R，序列如序列表NO：5所示；

(3)双酶切FGFR2基因与载体，连接构建重组载体，转化宿主菌，构建FGFR2基因工程菌；

(4)培养FGFR2基因工程菌，分离、清洗、溶解包涵体得到包涵体溶解液；

(5)纯化包涵体；

(6)复性；

(7)超滤、冻干得到可溶性人FGFR2胞外段。

2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤(1)所述扩增的条件是94℃，4min后，94℃，30s，64℃，30s，72℃，60s，32个循环，72℃，10min。

3.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤(3)所述载体为pET3c，双酶切所用的酶为Nde I和BamH I，所述宿主菌为大肠杆菌。

4.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤(4)所述培养FGFR2基因工程菌的培养基为LB培养基，培养温度为37℃。

5.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤(4)所述分离、清洗、溶解包涵体是将工程菌超声破碎，离心收集沉淀，用溶液1清洗，用溶液2溶解；所述溶液1为10-500mmol/L PB，1-20mmol/LEDTA，1-10％Triton X-100，pH6-8.5；所述溶液2为20-500mmol/LTirs-HCl，1-20mmol/L EDTA，3-6mol/L Guandine Hydrochloride，1-50mmol/L DTT，pH6-8.5。

6.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤(5)所述纯化包涵体是采用离子交换或凝胶层析纯化，所需平衡溶液为20-500mmol/L Tirs-HCl，1-20mmol/L EDTA，8mol/L urea，1-50mmol/LDTT，pH6-8.5；纯化方法为取5g包涵体用5ml溶液2溶解，离心去沉淀后上样，将纯化后产物对水透析，将产生的沉淀离心收获。

7.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤(6)所述复性是采用凝胶层析法、稀释法或透析法复性，复性液为：10-100mmol/LHEPES+0.5-10mmol/LEDTA+10-1000mmol/LNaCl+10-50mmol/L L-Cysteine，pH6-8.5。

8.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于步骤(7)所述超滤是采用分子量10000道尔顿的超滤膜超滤。

9.利用权利要求1所述生产方法得到的重组可溶性人FGFR2胞外段。

10.权利要求9所述重组可溶性人FGFR2胞外段在制备抗肿瘤药物中的应用。