[发明专利]重组PAC1受体结抗剂D(25－44)RMMAX及其表达方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体的说，涉及重组PAC1受体结抗剂D(25-44)RMMAX及其表达方法与应用。

背景技术

PAC1受体是垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylatecyclase activating polypeptide，PACAP)的特定受体，参与介导PACAP的多种生物学功能。PACAP是1989年发现的，由脑垂体分泌的或目的组织自分泌和旁分泌的具有重要生物学功能的神经多肽，属于是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成员。PACAP的具有3个受体：PAC1是PACAP的特异受体；VPAC1和VPAC2是PACAP和血管活性肠肽(VIP)的共同受体；PACAP对3个受体具有相同的激动功能。其中PAC1受体主要分布于中枢神经系统、周围神经系统以及睾丸、卵巢、呼吸道、肺、胰腺等非神经组织内等。目前已证实由PAC1介导的PACAP生物学功能有：神经递质/调质、保护神经细胞；神经损伤修复(眼角膜敏感度恢复，眼部手术后神经细胞突出形成)；调节血管；促进激素分泌，调节内分泌平衡；调节性腺功能和生殖细胞的产生；参与消化活动，调节能量代谢平衡；参与调节免疫系统；调节细胞增殖分化；与摄食睡眠有关；与学习和记忆有关；与某些心理感受有；与动物的生物钟有关；等等。

鉴于PAC1介导了PACAP的多种生物学功能，因此开发PAC1的特异激动剂和特异结抗剂具有巨大的药用开发的价值。例如我们发现PAC1受体特异激动剂具有显著的升糖的作用，而本专利公开的重组PAC1受体特异拮抗剂则具有协助机体降糖的作用，因此显示其在调节能量代谢方面具有应用价值。

目前已发现的PAC1特异拮抗剂是其激动剂maxadilan缺失24-42个氨基酸构成的d(24-42)max，d(24-42)max由42个氨基酸组成的多肽，本专利公开的D(25-44)RMMAX，由54个氨基酸组成，与d(24-42)max有80％同源性，但是是通过基因工程方法制备获得的重组多肽；而且D(25-44)RMMAX与d(24-42)max相比具有不同的N端和C端序列及修饰，赋予D(25-44)RMMAX更高的稳定性和活性。研究证明此重组多肽能有效结合PAC1受体，但不能激活受体，成为PAC1的特异拮抗剂。

本专利所制备的重组多肽，由于在制备过程中C端通过硫酯修饰，成为多肽硫酯，多肽硫酯定向诱导水解成为多肽硫代羧酸，使多肽的C端受到保护，有效地提高了重组多肽的稳定性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种具有高稳定性和高活性的PAC1受体特异拮抗剂D(25-44)RMMAX。

本发明的另一个目的是提供上述重组PAC1受体特异拮抗剂D(25-44)RMMAX的表达方法。

本发明的进一步目的是提供上述重组PAC1受体特异拮抗剂D(25-44)RMMAX的应用。

根据D(25-44)RMMAX的氨基酸序列，设计在原核表达的基因，采用基因工程的原理和技术，结合蛋白内含肽(intein)的可诱导剪切功能实现两条目的多肽的高效制备。具体包括如下步骤：(1)设计并合成D(25-44)RMMAX基因，如SEQ ID NO：1所示。

采用4条引物两步法合成D(25-44)RMMAX基因：引物F2和F43行链延伸反应；然后以其产物为模板，以F1和F4为引物，进行PCR，获得D(25-44)RMMAX基因；所述引物F1-4的核苷酸序列如下所示：

F1：GGTGGTGTCAT ATG GGC AGC ATT CTG TGC GAT GCG ACC TGC CAGTTT CGTAAA GCGATT

F2：TGC CAG TTT CGT AAA GCG ATT GAT GAT TGC CAG AAA CAG GCGCATACCAGC CAG CTG C

F3：TTT CTG TTT CAT GCA TTC TTTAAA CAC GCT GTT GCC CGG CAG CTGGCTGGT ATG CGC CT

F4：GGTGGTT CTC GAG TTT GCC CGC TTT AAA TTC TTT TTT TTT CTGTTT CAT GCATTC TTT