[发明专利]饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫的生长发育调控领域，且其涉及饲喂沉默特定基因的dsRNA在害虫的防治中之用途。具体而言，本发明涉及通过饲喂含有干扰昆虫几丁质合成酶基因的dsRNA对鳞翅目昆虫的基因表达进行抑制，从而调控其生长发育。

背景技术

RNA干扰或称RNA interference或RNAi，是dsRNA介导的的特异性基因表达沉默现象，是生物界一种古老且在进化上高度保守的基因表达调节机制，1998年首次在线虫.Caenorhabditis elegans中发现这种现象。RNAi作用的大致过程是：导入体内的或内源性转录生成的dsRNA被Dicer酶切割成21~25nt(碱基)的siRNA，siRNA进一步与其它多种蛋白成份结合形成RISC，最后由RISC介导siRNA反义链与靶mRNA分子互补结合引起同源性靶mRNA分子的切割效应。RNAi现已成为一种替代基因敲除而研究基因功能的有力工具。在昆虫基因功能的研究方面，RNAi已得到了广泛应用并取得了令人激动的结果。Caplen等2002年发现在白纹伊蚊Aedes albopictus C6/36细胞内，dsRNA可以特异性抑制C6/36细胞中质粒和SFV复制子的表达，并能显著的调节DEN1RNA和病毒复制的活力。这项研究揭示在蚊子细胞中dsRNA可以抑制基因的表达和病毒的复制，并显示这种机理可以被用来阻断昆虫寄主体内病毒的复制进而达到阻止疾病传播的目的(N.J.Caplen，Z.Zheng，B.Falgout，R.A.Morgan，Molecular Therapy 6，243(2002).)。这就说明RNAi不仅可以作为一种研究基因功能的工具，而且有可能开发成一种治疗疾病和控制害虫的药物。Amdam等2003年将意大利蜜蜂Apismellifera 504bp的卵黄蛋白基因的dsRNA注射入工蜂卵内，发现15％的卵黄蛋白mRNA水平显著降低；而对刚羽化的蜜蜂成虫注射dsRNA，发现有96％的个体都产生了突变表型(G.Amdam，Z.Simoes，K.Guidugli，K.Norberg，S.Omholt，BMC Biotechnology 3，1(2003).)。Tomoyasu等2004年研究发现把GFP dsRNA注射入转GFP基因的赤拟谷盗Tribolium castaneum幼虫体内，在注射后不久即可观察到幼虫体内GFP表达受到抑制，而且在整个蛹期和成虫期这种抑制现象还可以持续性的观察到；他们同时对T.castaneum刚毛基因的RNAi研究得到了成虫体表刚毛的缺失(Y.Tomoyasu，R.E.Denell，Development Genes and Evolution 214，575(2004).)。上述实验证明dsRNA不仅在单个细胞内可以特异性的抑制目标基因的表达，而且在整个昆虫个体及其所有的发育阶段也可以对基因的表达产生阻抑，并且可以观察到目标基因受到阻抑后的RNAi表型。这充分说明RNAi可以作为一种研究昆虫基因功能的有力工具。

在昆虫中现在用RNAi研究基因功能的方法主要是注射法，一般通过把dsRNA或siRNA用微量注射器导入昆虫胚胎或体腔对靶mRNA进行沉默来研究所需基因的功能。注射法RNAi虽然在昆虫基因功能的研究方面取得了很大的成果，但是它亦有如下的缺点：首先是对实验操作人员有较高的注射技术要求，劳动强度大；其次注射dsRNA或siRNA基本都需要用试剂盒来制备比较纯的双链RNA，这增加了实验的成本；再次注射法仅可以用于研究某种昆虫中某个基因的功能，无法说明如果某种昆虫如果取食某个基因的dsRNA是否对其生长发育的影响；还有注射法需要人工单个实施，注射法RNAi研究无法直接广泛使用在害虫的有效控制上。