[发明专利]饲喂dsRNA抑制昆虫基因表达的方法

权利要求书

1.一种饲喂dsRNA抑制甜菜夜蛾Spodoptera exigua或斜纹夜蛾Spodoptera litura基因表达的方法，通过dsRNA触发的基因沉默来抑制特定基因mRNA在甜菜夜蛾或斜纹夜蛾的发育过程中的表达，其特征在于：主要包括以下步骤：

①选定特定功能的dsRNA片段：该特定功能的基因为昆虫几丁质合成酶基因SeCHS-A，选定特定功能的dsRNA片段为SeCHS-A基因上一段特异性的基因片段SeA3，该基因片段SeA3的基因序列为如附录SEQ ID NO1所示；

②提取甜菜夜蛾五龄幼虫的总RNA，通过RT-PCR得到cDNA；

③通过PCR技术扩增出目的基因片段SeA3：根据选用昆虫几丁质合成酶基因SeCHS-A，设计一对基因特异引物——SeCHSA3_F和SeCHSA3_R，以上一步得到的cDNA作为模板，通过PCR技术扩增出目的基因片段SeA3片段，其中，正向引物SeCHSA3_F的基因序列为5′-TCGCCATGGTTGTATTCTTCTTCGCCTTG-3′，反向引物SeCHSA3_R的基因序列为5′-GACAAGCTTGTCGCCTATGGTGGTTTCGT-3′；

④构建含有选定的dsRNA片段的重组表达载体：选用载体L4440为构建重组表达载体的空载体，将此基因片段SeA3用T4DNA连接酶插入载体L4440中，构建重组表达载体L4440-SeA3，转化入宿主菌——大肠杆菌DH5α中；

⑤重组表达载体向受体菌的转化：从上一步骤的大肠杆菌DH5α中回收纯化重组表达载体L4440-SeA3，再将该重组表达载体L4440-SeA3转化入dsRNA表达受体菌——大肠杆菌HT115(DE3)中；

⑥通过基因诱导使受体菌表达SeA3的dsRNA片段：在一定的温度、转速和时间下诱导转化入受体菌HT115(DE3)中的重组表达载体L4440-SeA3表达相应昆虫基因片段的dsRNA片段； 

⑦对表达了dsRNA片段的受体菌进行纯化、富集：将前一步获得的已经表达了dsRNA片段的受体菌即大肠杆菌HT115(DE3)进行纯化、富集；

⑧将富集的表达了dsRNA片段的受体菌加入饲料并喂养甜菜夜蛾或斜纹夜蛾幼虫：将富集表达了dsRNA片段的大肠杆菌HT115(DE3)用适当的无菌水稀释，按照一定的比例均匀加入甜菜夜蛾或斜纹夜蛾人工饲料中，饲喂适当龄期的甜菜夜蛾或斜纹夜蛾幼虫，饲料每天更换；

⑨采用RT-PCR检测甜菜夜蛾或斜纹夜蛾幼虫的SeCHS-A基因的表达：饲喂特定的时间后，取甜菜夜蛾或斜纹夜蛾幼虫做RT-PCR检测，检测其SeCHS-A基因的表达情况；并持续饲养为取材检测的幼虫，记录幼虫经RNAi后的表现型；

⑩检测甜菜夜蛾或斜纹夜蛾幼虫的SeCHS-A基因的表达情况。

2.如权利要求1所述饲喂dsRNA抑制甜菜夜蛾或斜纹夜蛾基因表达的方法，其特征是：所述的步骤⑥中，所述基因诱导的温度为25℃-40℃之间任一温度，所述转速为150rpm-300rpm之间任一转速，所述时间为2小时-24小时之间任一时间长度。

3.如权利要求1所述饲喂dsRNA抑制甜菜夜蛾或斜纹夜蛾基因表达的方法，其特征是：所述饲喂甜菜夜蛾或斜纹夜蛾幼虫的适当龄期为幼虫发育一龄到五龄之间的任一龄期。

4.如权利要求1所述饲喂dsRNA抑制甜菜夜蛾或斜纹夜蛾基因表达的方法，其特征是：所述饲喂特定的时间为连续饲喂幼虫后1～15天的任一时间。

5.如权利要求1所述饲喂dsRNA抑制甜菜夜蛾或斜纹夜蛾基因表达的方法，其特征是：所述饲喂甜菜夜蛾或斜纹夜蛾幼虫的方法是直接自然喂养。