[发明专利]家蝇抗菌肽基因及其筛选克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域中的基因克隆技术，具体涉及一种家蝇抗菌肽基因及其筛选克隆方法。

背景技术

家蝇抗菌肽是一类由结构基因编码的小分子肽类物质，是构成其自身免疫体系的重要组分，其分子量小，热稳定性、水溶性好，抗原性低等特点，具有广谱的抗细菌、抗病毒、抑肿瘤细胞、原虫等多种生物活性，且对耐药菌株也有明显的杀伤作用，作用的机理也非常独特。主要作用于病原体细胞膜而起作用，因此不易产生耐药性，且对正常真核细胞几乎无作用，近年研究发现还具有清除氧自由基、抗辐射、提高机体免疫、促进伤口愈合等功能；特别是对耐药菌株和癌细胞的杀伤作用更为引人关注，人们期望通过基因工程方法能开发出新型肽类药物，或者将其转入动植物体内，使其抗病性能得到增强、在食品行业中期望可作为绿色防腐剂、饲料加工业作无害添加剂及农业中开发成无公害农药等产品。

传统研究家蝇抗菌肽多采用化学方法从其血淋巴中提取纯化，但因其血淋巴成分复杂，分离纯化较困难，且直接提取成本高、产率低，效益上很不经济。若用基因工程方法生产抗菌肽是较理想途径，而基因源是其首要前提和关键。

国外有关家蝇抗菌肽的研究少有报道，国内学者采用分离纯化方法发现其体内存在有多种高活性的抗菌物质，在其它昆虫体内也是如此，如从双翅目果蝇(Drosophila)体内已发现了7种不同类型的抗菌肽，鳞翅目家蚕(Bombyxmori)体内也发现了8种不同的抗菌肽；到目前为止从家蝇体内还只克隆到了Cecropin、Attacin、Defensin三个抗菌肽基因，这与传统分离研究所发现的抗菌活性物质数量明显不符，证明其体内可能还有其它抗菌肽基因未被发现。从已克隆到的这三个基因来看，发现与其它昆虫同类抗菌肽基因存在很大的同源性，在其编码区同源性最高，且存在保守的结构域。

家蝇从幼虫到成虫常生活在垃圾堆、禽畜粪便等有多种病原菌孳生的环境中，携带有害病原微生物约60多种，能在人、畜中通过机械传播多种疾病，而自身并不染病，且不具有高等动物那样高度专一的免疫体系，亦缺乏B、T淋巴细胞系统，也无免疫球蛋白和补体的存在，仅依赖于其独特的天然免疫系统抵抗各种微生物的感染，抗菌肽在其中起着主要的作用。该作用是否是因各抗菌肽协同所产生的合力所致还是每一抗菌肽作用于不同病原微生物所产生的结果还不很清楚。因此，为了全面揭示家蝇抗菌肽在其免疫防御中的作用，给下一步研究其在体内的时相及空间分布的表达模式奠定基础，也为今后用基因工程方法研究其抗菌肽提供基因源，有必要对其抗菌肽相关基因进行筛选。

随着后基因组时代的到来，基因序列数据、蛋白质及其相关信息等均以指数的速度增长，其中生物信息学(bioinformatics)在研究基因与蛋白质的表达与功能、各功能基因的发现与识别等方面发挥着极其重要的作用，并已广泛渗透到生命科学的各个研究领域，成为生命科学研究者一门不可缺少的工具。基因芯片技术将大量生物分子作为探针用点样仪有序地点印在特制玻片、硅片等支持物表面，组成密集的二维分子阵列。按照碱基互补配对原理，在固相支持物上通过原位合成(in situ synthesis)寡核苷酸或者直接将大量特定DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析来得出样品的遗传信息即基因序列及表达的信息。

近年来随着核酸合成技术的进步，使得人工合成长链寡核苷酸做探针点样制备基因芯片已成现实，且人工合成oligo探针简单直接，所构建的微阵列具有更好的特异性和较均一的Tm值等优点，可提高芯片杂交时的稳定性和可重复性；研究表明长度为50～70bp的寡核苷酸探针足以代表一个基因，且其灵敏度和特异性两方面都最佳，因此可以采用人工合成长度为50bp的寡核苷酸探针来构建微阵列，作为高特异性探针来筛选家蝇抗菌肽相关基因。

综上所述，有必要对家蝇抗菌肽相关基因进行筛选克隆，而且倾向于采用人工合成oligo探针、直接点样法制备好的芯片与已标记的待测家蝇生物样品中靶分子杂交，达到筛选目的。但是，现有的技术对生物样品的mRNA质量控制不好，影响了对芯片进行杂交的结果影响和限制了这一领域相关技术的发展及应用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的家蝇抗菌肽基因，选择经诱导的家蝇三龄期幼虫，利用基因芯片技术筛选克隆得到一种新的新的家蝇抗菌肽基因，并提供其序列。

本发明另一个目的是提供所述家蝇抗菌肽基因的筛选克隆方法，从探针的设计、杂交和洗片条件的精确限制而确定的基因芯片技术，以保证得到较好、较忠实的杂交效果，达到发明目的。