[发明专利]家蝇抗菌肽基因及其筛选克隆方法

权利要求书

1.一种家蝇抗菌肽基因，其特征在于序列表如SEQ ID NO：1，全长460bp，从57bp～356bp、起始密码子为ATG、终止密码子为TAA、含300bp的区域编码99个氨基酸。

2.权利要求1所述家蝇抗菌肽基因的筛选克隆方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)采用基因芯片技术筛选出家蝇相关基因；

(2)设计简并引物，获取同源片断；

(3)行RT-PCR扩增出基因片段；

(4)以全长文库做模板，结合文库通用引物行特异性PCR扩增出该抗菌肽基因的全长序列。

3.根据权利要求2所述家蝇抗菌肽基因的筛选克隆方法，其特征在于步骤(1)包括以下步骤：

(1)设计探针，将探针点印在芯片上构建寡核苷酸探针微阵列，打印好的芯片经紫外交联处理后放暗盒中保存备用；

(2)芯片预杂交处理；

(3)提取和纯化家蝇脂肪体总RNA，逆转录成cDNA并标记上荧光标记物Cy3，与构建的寡核苷酸探针微阵列芯片杂交；

(4)经洗片、扫描处理后进行数据分析。

4.根据权利要求3所述家蝇抗菌肽基因的筛选克隆方法，其特征在于步骤(3)所述家蝇是经过诱导的家蝇三龄期幼虫。

5.根据权利要求4所述家蝇抗菌肽基因的筛选克隆方法，其特征在于所述诱导是取家蝇三龄期幼虫，用昆虫针蘸取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液，从腹部进行刺针，再放回饲养24小时后收集。

6.根据权利要求2所述家蝇抗菌肽基因的筛选克隆方法，其特征在于步骤(2)所述设计简并引物为：

上游简并引物A1：5′-GHGGHWSBCCHAARGATGG-3′19bp

下游简并引物A2：5′-RTTDCCRTADGGDCCDCC-3′18bp。

7.根据权利要求2所述家蝇抗菌肽基因的基于基因芯片筛选克隆方法，其特征在于步骤(3)所述行RT-PCR扩增出基因片段包括目的基因cDNA的3′端克隆和目的基因cDNA 5′端克隆。

8.根据权利要求7所述家蝇抗菌肽基因的基于基因芯片筛选克隆方法，其特征在于所述目的基因cDNA的3′端克隆引物为

上游引物B1：5′CAA TGT AAA TGC CGA TGT C 3′(19bp)

下游引物p2：5/ TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC 3/(21bp)。

9.根据权利要求7所述家蝇抗菌肽基因的基于基因芯片筛选克隆方法，其特征在于所述目的基因cDNA 5′端克隆引物为

上游引物P1：5/  CTC CGA GAT CTG GAC GAG C 3/    (19bp)

下游引物B2：5′TTA CAT TGC CTT AAA AAT CAC CT 3′(23bp)。