[发明专利]基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白及制备

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程蛋白质药物领域，更具体地，本发明涉及基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合蛋白及其制备方法，这些融合蛋白的氨基酸序列由三部分组成：从N-端开始依次为胶原蛋白序列、(一种或一类)人基质金属蛋白酶底物序列和人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)序列，进一步涉及这些融合蛋白基因、工程菌、融合蛋白在原核细胞中的表达、融合蛋白的分离纯化，以及对恶性肿瘤细胞具有靶向作用和特异杀伤作用的证据。 

背景技术

恶性肿瘤是对人类健康与生命危害最大的疾病之一。随着肿瘤免疫学、分子生物学和基因工程技术的飞速发展，细胞因子疗法成为抗肿瘤的分子治疗学研究热点。而利用生物工程技术在分子水平改造细胞因子结构以增强其抗瘤活性和降低毒性的有效探索，有望为细胞因子治疗肿瘤开辟一条新的途径。 

1.肿瘤坏死因子的研究进展 

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是一种多功能细胞因子，具有广泛的生物活性，参与机体的免疫调节和抗肿瘤作用，它是迄今为止发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子。 

(1)肿瘤坏死因子的生物学功能 

TNF自1975年发现以来，一直受到世界各国学者的重视。TNF有TNF-α和TNF-β两种类型。前者又被称为恶病质素，主要由单核巨噬细胞产生；后者又被称作淋巴细胞毒素，由活化的淋巴细胞产生。1984年获得了人TNF- α的cDNA克隆并在大肠杆菌中成功表达。在此基础上人们对TNF的理化性质、生物活性及临床应用进行了广泛研究。TNF具有广泛的生物活性，其最显著特征是在体内外能特异性地直接杀伤肿瘤细胞，TNF的抗肿瘤作用主要是由于：①TNF为激发性细胞因子，可启动广泛的免疫炎性反应，介导天然细胞毒细胞、单核细胞和巨噬细胞对癌细胞的杀伤和溶瘤作用；②TNF可作用于血管内皮细胞，使肿瘤的血管变形受损或形成血栓，导致肿瘤发生出血性坏死或因营养缺乏而消退；③TNF可通过诱导某些肿瘤细胞凋亡来抑制癌细胞增生。 

由于其广泛的抗肿瘤作用和免疫调节作用，故TNF-α治疗肿瘤的动物实验和临床研究已在许多国家进行，美国FDA早在1984年就批准用TNF-α治疗肿瘤的临床试验。动物实验和临床研究表明，TNF-α对神经纤维瘤、肺癌、乳腺癌、肌肉瘤和淋巴瘤等肿瘤细胞具有明显的杀伤作用。但是，由于TNF-α的毒副作用大而严重限制了其临床应用，毒副作用包括发热、头痛、恶心、呕吐、全身倦怠和肌肉酸痛等症状，大剂量使用可导至严重的低血压、休克、DIC形成甚至死亡。TNF-α的上述缺陷，为其直接进入临床应用造成了很大困难。但考虑到TNF-α是迄今为止发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子，因此，人们一直在努力开发其潜能。降低TNF-α的毒副作用和增强肿瘤靶向性是解决这一难题的两个关键。 

(2)肿瘤坏死因子分子结构与作用机制 

人TNF-α基因定位于人类第6号染色体上，与HLA基因连锁。编码产物先是由233个氨基酸残基组成的前体，含有一段由76个氨基酸残基组成的信号肽，切除信号肽后转化成成熟的TNF-α，其分子量为17kD，含157个氨基酸残基，无糖基化位点，第69位的cys和第101位的cys形成分子内二硫健。人TNF-α的活性形式是由三个17kD亚基以同源三聚体的形式存在，每个亚基通过β折叠以边对面的堆积方式形成的外观近似金字塔(三角锥)的三聚体分子。TNF-α的各种生物学效应是通过与靶细胞膜上的TNF受体结合而产生的，其受体存在于多种正常细胞及肿瘤细胞表面，分为两种类型：TNFR1和TNFR2。TNF-α与两种受体的结合并无特异性，其受体结合部位位于金字塔的底部，N末端的(7个)氨基酸序列游离于底部并且可 能影响其与受体的结合。TNFR1胞内结构域中含有一个约90个氨基酸组成的“死亡域”(death domain，DD)，而TNFR2没有。TNFR1产生的信号介导细胞凋亡和通过激活核转录因子NF-κB而使细胞增殖、分化；TNFR2则通过不同于TNFR1，但在某些环节可发生交叉反应的信号传导途径激活NF-κ B，使细胞增殖和分化。 

(3)肿瘤坏死因子融合蛋白的研究进展