[发明专利]根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法

说明书

技术领域

根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母，将外源基因整合到宿主染色体上，属于基因工程中转化技术领域。

背景技术

转化是酵母基因操作技术中的重要步骤之一。由于酵母细胞不像大肠杆菌和枯草芽胞杆菌等原核微生物那样具有可以将外源DNA摄入细胞内的特殊生理状态(感受态)，因此酵母转化曾是酵母基因工程研究的一大限制因素。目前广泛采用的酵母转化方法主要有原生质体转化法、醋酸锂转化法、电击转化法等。这些方法在酿酒酵母的遗传转化研究上已取得了巨大的成功。

由于工业应用酵母菌株和实验室用的酵母菌株在细胞壁结构、生理生化特性、遗传背景及生长环境等方面存在巨大的差异，在转化工业应用酵母时需要建立相对应的转化体系。但是，上面所述的转化方法在转化一些工业酵母菌株时往往存在转化率低、转化子稳定性差、难以重复等困难，有些菌株甚至无法转化。针对这一问题，研究人员提出了不同的改进方法以及新的转化方法。其中，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化法是有效的方法之一。

1995年Bundock等首次成功进行了根癌农杆菌介导酵母菌的遗传转化。进一步研究发现根癌农杆菌介导的遗传转化法具有转化低拷贝、高频率转移、成本低、稳定性好、操作方便和重复性好、能转化大片段DNA(大到50Kb的外源DNA)、能明显提高转化率获得稳定的转化子等优点，在应用领域中具有很大的潜能。

产甘油假丝酵母是目前我国用于工业化发酵生产甘油的优良菌株之一，它具有甘油产率高、耐高渗压、发酵条件粗放、菌体生长速度及发酵速度快、转化率高、发酵原料简单等优点。除了甘油，产甘油假丝酵母还能产生多种其他多元醇，如赤藓醇、D-阿拉伯醇和甘露醇等，因此是一株具有很高的潜在应用价值的酵母。采用基因工程手段构建重组菌是进一步改进产甘油假丝酵母性能的途径，实现这一目标首先要获得有效的载体和转化方法，在此基础上才有可能对产甘油假丝酵母代谢途径进行有目的的改造，以达到提高甘油产量和改善工艺的目的。成功建立其遗传转化体系能改进甘油生产，还可以为通过代谢工程进一步构建高产其他多元醇的重组菌创造条件，所采用的转化方法和载体构建方法也能为其他耐高渗酵母的基因工程改造提供借鉴。因此，建立产甘油假丝酵母的遗传转化体系具有重要意义。

本发明采用根癌农杆菌转化系统来转化产甘油假丝酵母，实现了产甘油假丝酵母的遗传转化体系的成功建立。

发明内容

本发明的目的是提供一种根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法，构建双元载体成功地实现了根癌农杆菌介导产甘油假丝酵母的转化。并针对产甘油假丝酵母生长快的特点对转化条件进行了适当的优化。为进一步研究产甘油假丝酵母打下了良好的基础。

本发明的技术方案：根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法，是以质粒pPICZB为模板通过PCR技术获得zeocin抗性基因，再与线性化质粒pCAM 3300连接，获得重组质粒pCAM 3300-zeocin；质粒pCAM 3300-zeocin转化根癌农杆菌LBA4404，再和产甘油假丝酵母共培养，根癌农杆菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin质粒转化工业化产甘油假丝酵母；

(1)zeocin基因的克隆

根据zeocin基因的特异性设计引物：

引物R：5’-GTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG-3’；

引物F：5’-ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC-3’；

PCR扩增zeocin基因得到300bp的特异条带；

PCR方法如下：取质粒pPICZB模板1μL，10×PCR缓冲液2μL，引物R、F各1μL，dNTPs2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，总反应体积为20μL；循环参数：94℃预变性5min，94℃45s，56℃90s，72℃90s，35个循环，72℃延伸10min；

通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片断胶回收试剂盒纯化出0.3kb的目标片断，纯化好的目标片断与pEGM-T-Easyvector连接保存；再用相应EcoRI酶切，胶回收zeocin目标基因，EcoRI酶切线性化质粒pCAM3300；在T4连接酶的作用下连接得到pCAM3300-zeocin；

(2)质粒pCAM3300-zeocin转化根癌农杆菌LBA4404