[发明专利]根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法

权利要求书

1.根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法，其特征是以质粒pPICZB为模板通过PCR技术获得zeocin抗性基因，再与线性化质粒pCAM 3300连接，获得重组质粒pCAM 3300-zeocin；质粒pCAM 3300-zeocin转化根癌农杆菌LBA4404，再和产甘油假丝酵母共培养，根癌农杆菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin质粒转化工业化产甘油假丝酵母；

(1)zeocin基因的克隆

根据zeocin基因的特异性设计引物：

引物R：5’-GTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG-3’；

引物F：5’-ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC-3’；

PCR扩增zeocin基因得到300 bp的特异条带；

PCR方法如下：取质粒pPICZB模板1μL，10×PCR缓冲液2μL，引物R、F各1μL，dNTPs 2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，总反应体积为20μL；循环参数：94℃预变性5min，94℃45s，56℃ 90s，72℃ 90s，35个循环，72℃延伸10min；

通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片断胶回收试剂盒纯化出0.3kb的目标片断，纯化好的目标片断与pEGM-T-Easyvector连接保存；再用相应EcoR I酶切，胶回收zeocin目标基因，EcoR I酶切线性化质粒pCAM 3300；在T4连接酶的作用下连接得到pCAM 3300-zeocin；

(2)质粒pCAM 3300-zeocin转化根癌农杆菌LBA4404

将重组质粒pCAM 3300-zeocin通过电击直接转入根癌农杆菌LBA4404，在卡那霉素抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证，得到重组菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin ；

(3)根癌农杆菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin质粒转化工业化产甘油假丝酵母：

将重组菌LBA4404/pCAM 3300-zeocin于LB培养基中，30℃，200 r/min摇床培养36 h，离心收集菌体；用等体积的IM培养基重悬，培养6h；接种产甘油假丝酵母WL2002-5于YPD培养基中，30℃、200r/min摇床培养过夜；产甘油假丝酵母的YPD培养液按1∶5稀释到YPD新鲜培养基中，培养6h；分别离心收集根癌农杆菌菌体和产甘油假丝酵母，用生理盐水清洗一次，用IM培养基重悬菌体，产甘油假丝酵母细胞终浓度达到10⁹个/mL，根癌农杆菌细胞终浓度达到10¹¹个/mL，各取50μL加入20mL IM培养基中30℃200r/min共培养过夜；取200μL培养液涂布铺有玻璃纸的IM+AS固体培养基平板置于25℃培养24h；将玻璃纸转接到SM培养基上培养两天，筛选阳性酵母转化子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是重组根癌农杆菌LBA4404/pCAM3300-zeocin介导转化产甘油假丝酵母WL2002-5的优化转化条件：

(1)IM固体培养基诱导时间优化：优化的共培养时间为24h；

(2)共培养根癌农杆菌菌体浓度优化：产甘油假丝酵母比根癌农杆菌菌体细胞比例为1∶500-1000时，最高转化率达到2个转化子/10⁴个酵母细胞。