[发明专利]D－乳酸诊断/测定试剂盒及D－乳酸浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有D-乳酸特异性的D-乳酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定D-乳酸浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。

背景技术

L-乳酸是近年来人们十分关注并发展较快的有机酸。同时L-乳酸具有在食品、饲料、医药、塑料、饲料、农药、日用化工、造纸及电子工业等多领域应用前景。

L-乳酸是大多数生物体代谢作用的终产物。仅少数微生物(例乳酸菌属、明串珠菌属)能形成D-乳酸。生产酸奶时非常注意检测乳酸盐，以评估微生物是否产生L-乳酸，D-乳酸或二者兼有。若有D-乳酸存在，则可能是微生物造成了污染。

乳酸盐浓度的异常升高与多种疾病如糖尿病、酸毒症等疾病有密切的关系。L(+)-Lactate是人体中乳酸盐代谢的主要中间产物，并且存在于血液中。D(-)-Lactate也存在，但含量很低，只有L(+)-Lactate的1-5％。

血乳酸测试作为一个监护、监测运动员训练能力的手段，把血乳酸值作为衡量运动员有氧耐力水平、无氧训练能力、身体疲劳恢复等方面的一个重要数据，供安排训练时参考。

酶法分析是国际上公认的分析方法，已被多个国际权威组织或机构采纳：如IFU(国际果汁生产者协会)，AIJN(欧盟果蔬汁及饮料生产者联盟)，及MEBAK，OICC，VDLUFA等组织广为推崇，并确定为标准检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用具有D-乳酸特异性的酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致在400-700nm波长处吸光度的上升，得以测定D-乳酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的D-乳酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行D-乳酸浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明D-乳酸浓度测定方法原理如下：

D-乳酸+2高铁细胞色素c D-乳酸脱氢酶丙酮酸+2亚铁细胞色素c

丙酮酸+氨离子+还原型辅酶 丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸+水+辅酶

丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨离子+丙酮酸+过氧化氢

过氧化氢+还原型色原体组合 过氧化物酶 吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水

这种方法应用具有 D-乳酸特异性的 D-乳酸脱氢酶(D-Lactatedehydrogenase；EC 1.1.2.4；EC 1.1.2.5)酶联丙氨酸脱氢酶(alaninedehydrogenase；EC 1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine oxidase；EC 1.4.3.19)及过氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)酶促反应终点/速率比色法。D-乳酸脱氢酶作为作用酶，功能为将D-乳酸酶解产生丙酮酸。丙氨酸脱氢酶也作为作用酶，它的酶促作用使丙酮酸产生丙氨酸；甘氨酸氧化酶作为循环酶可以一再将丙氨酸再次变回丙酮酸，使丙酮酸不断地被重复循环利用；同时不断地重复循环产生过氧化氢。过氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)作为显色酶，通过和过氧化氢的作用，使无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处测定染料-吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)-含量高低的光吸收大小程度/速度，得出氨基酸(氮)浓度大小测定结果。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分关系的本发明D-乳酸诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液            100mmol/L

稳定剂            500mmol/L

还原型辅酶        0.25mmol/L

2高铁细胞色素c    10mmol/L

氨离子            20mmol/L

D-乳酸脱氢酶      10000U/L