[发明专利]一种大白菜特异蛋白质/同工酶的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于植物蛋白质组学和发育生物学技术领域，具体涉及一种从白菜花蕾中提取分离特异蛋白质/同工酶的方法。

背景技术

生物功能的主要执行者是蛋白质，蛋白质组能够反映出生物系统所处的状态，如细胞周期的特定时期、分化的不同阶段，不同的生长和营养状况，温度、应激和病理状态等都有其特异蛋白质组，因此蛋白质组学的研究可望提供精确、详细的有关细胞或组织状况的分子描述。科学界预言：21世纪生命科学的热点将从基因组学转入蛋白质组学，后者将成为新的研究前沿。

蛋白质组学的研究中亟待解决的问题是：如何才能分离纯化出自己感兴趣的特异酶或蛋白。

分离纯化某一特定蛋白质或酶没有特定的方法，一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。前处理指把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。一般粗分级这一步的分离多用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。细分级一般使用较多的是层析法，层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。层析法的操作过程多是在室温下进行，不稳定的蛋白尤其是酶很容易被降解，对纯化很是不利。另外值得注意的是一般的酶蛋白量都比较低，用层析法进行分离有时会遇到不出现峰的现象，所以目的酶常被当成废液而被丢弃，没办法回收，因此聚集和纯化低含量具有生命活性功能的蛋白质，尤其是同工酶，成为蛋白质组学研究的瓶颈。

双向电泳由于其具有高分辨能力使之成为蛋白质组学研究中蛋白质分离最有力的技术平台。其实验过程一般包括样品制备、等电聚焦(IsoelectricFocusing IEF)、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、染色和图像分析等步骤。第一向等电聚焦电泳目前多采用进口的商品干胶条进行，需要专门的设备，价格昂贵；操作时间长，一般都需要20小时以上；聚焦完毕不进行染色，直接进入下步的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，整个过程相当于黑箱操作，聚焦好坏不能及时获知，必需待到第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳染色完毕才可知。第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳每板凝胶只能上一根胶条即一个样品，要想分析比对多个样品需进行多板凝胶的配制及电泳，无形间增加了比对结果的误差。第一向等电聚焦电泳凝胶上不仅包括了目的酶或蛋白，还包含有其它杂质蛋白，这些杂质蛋白会随同目的蛋白一起转到第二向进行再分离，结果使得第二向出现众多的蛋白点，为寻找目的蛋白增添了一定的难度，这些问题的存在成为蛋白质快速分离纯化研究的难点。

总之，蛋白质组学的发展需求快速、准确、低成本的蛋白质分离纯化技术。

发明内容

本发明的目的在于通过解决聚集和纯化低含量具有生命活性功能的蛋白质的问题、在等电聚焦电泳同时分析多个样品、SDS聚丙烯酰胺凝胶同时上多个目的条带、全程检测、提高目的性等问题，提供一种从白菜花蕾中提取分离特异蛋白质/同工酶的方法，该方法为进一步蛋白质测序、蛋白质组学研究奠定基础。

为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案得以实现：

一种从白菜花蕾中提取分离特异蛋白质/同工酶多肽的方法，其特征在于，该方法首先采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术鉴定目标性状的特异蛋白质/同工酶带，接着回收特异带区，浓缩成特异带干粉(聚集)，再通过IEF电泳系统鉴定区分特异带的等电点差异，最后通过SDS凝胶电泳分离目标多肽，使组成特异蛋白质/同工酶的多肽完全分离纯化，具体包括下列步骤：

步骤一，特异蛋白质/同工酶的鉴定分析

采用普通不连续聚丙烯酰胺活性凝胶系统分析比较对照与处理间蛋白质/同工酶图谱的差异，确定特异蛋白质/同工酶带，采用的分离胶浓度为7％，浓缩胶浓度为4％，浓缩胶电泳电压100V，分离胶电泳电压260V；

步骤二，特异蛋白质/同工酶带回收

采用单向活性凝胶制备系统，不制点样孔，直接于浓缩胶上上样分离(聚集)，电泳完毕后切取凝胶板两侧5-10mm宽的凝胶条染色，染色后放回原凝胶板两侧指示特异蛋白质/同工酶，如果目的带有多条，而且相互间距离较近，单条回收有困难时，可将这些目的带作为一个区进行回收；根据实验所需，确定凝胶回收量；

步骤三，特异蛋白质/同工酶干粉制备

根据染色胶条指示的位置，切取未染色的目的条带凝胶或带区凝胶，放入事先准备好的透析袋中，向透析袋中加入适量电极缓冲液，封住透析袋口并置于水平电泳槽中，用20mA的恒流过夜电洗脱，电洗脱完毕后用镊子取出凝胶，收集蛋白质/同工酶粗液，粗液再经透析除盐、真空冷冻干燥后得到粗蛋白质/同工酶干粉(聚集)；