[发明专利]一种大白菜特异蛋白质/同工酶的分离纯化方法

权利要求书

1.一种从白菜花蕾中提取分离特异蛋白质/同工酶多肽的方法，其特征在于，该方法首先采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术鉴定目标性状的特异蛋白质/同工酶带，接着回收特异带区，浓缩成特异带干粉，再通过IEF电泳系统鉴定、区分特异带的等电点差异，最后通过SDS凝胶电泳分离目标多肽，使组成特异蛋白质/同工酶的多肽完全分离纯化，具体包括下列步骤：

步骤一，特异蛋白质/同工酶的鉴定分析

采用普通不连续聚丙烯酰胺活性凝胶系统分析比较对照与处理间蛋白质/同工酶图谱的差异，确定特异蛋白质/同工酶带，采用的分离胶浓度为7％，浓缩胶浓度为4％，浓缩胶电泳电压100V，分离胶电泳电压260V；

步骤二，特异蛋白质/同工酶带回收

采用单向活性凝胶制备系统，不制点样孔，直接于浓缩胶上上样分离，电泳完毕后切取凝胶板两侧5-10mm宽的凝胶条染色，染色后放回原凝胶板两侧指示特异蛋白质/同工酶，如果目的带有多条，而且相互间距离较近，单条回收有困难时，可将这些目的带作为一个区进行回收；根据实验所需，确定凝胶回收量；

步骤三，特异蛋白质/同工酶干粉制备

根据染色胶条指示的位置，切取未染色的目的条带所在位置的凝胶或带区凝胶，放入事先准备好的透析袋中，向透析袋中加入适量电极缓冲液，封住透析袋口并置于水平电泳槽中，用20mA的恒流过夜电洗脱，电洗脱完毕后用镊子取出凝胶，收集蛋白质/同工酶粗液，粗液再经透析除盐、真空冷冻干燥后得到粗蛋白质/同工酶干粉；

步骤四，特异蛋白质/同工酶的IEF电泳分离的纯化

用制备的粗蛋白质/同工酶干粉进行IEF凝胶电泳，考马斯亮兰染色，验证特异性、检测区分等电点；

步骤五，特异蛋白质/同工酶的SDS凝胶电泳分离

挖去IEF凝胶中的目的蛋白质带，进行SDS凝胶电泳。采用15％的凝胶浓度，在20×20cm的垂直凝胶板上进行，先用5mA恒流预电泳2小时，然后将切取IEF目的凝胶条带放入点样孔，先用8mA恒流电泳2小时进行浓缩，再用18mA恒流电泳9.5小时进行分离；最后用考马斯亮兰染色。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的特异蛋白质/同工酶多肽的IEF凝胶电泳，包括：

(1)样品裂解：以1mg粗蛋白质/同工酶干粉，在30ul裂解液进行样品裂解，该裂解液组成：尿素8M，CHAPS4％，DTT65mM，pH为3.5～10的Ampholyte 0.2％；

(2)IEF胶配制：尿素6g，pH为3.5～pH10的Ampholyte 48ul，pH为3.5～7的Ampholyte 240ul，ddH2O 2ml，APS 40ul，TEMED 12ul；

(3)垂直板IEF电泳参数：200V预电泳1h，250V电泳30min，280V电泳至电流接近0；

(4)胶条平衡：IEF电泳完毕，用10％的TCA固定10min，然后经考马斯亮兰染色至显带，蒸馏水冲洗，切下目的条带并将其放入平衡液中平衡25min，直接用于二向凝胶电泳或-20℃保存备用；

所述的平衡液为0.125mol/L Tris-HCl，0.1％SDS。