[发明专利]一种获得柳枝稷转基因植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及生物能源植物柳枝稷的基因转化，进一步涉及一种采用农杆菌介导法转化获得柳枝稷转基因植株的方法。

背景技术

利用转基因技术对能源植物进行遗传改良是现代基因工程技术在农业领域运用的新突破。柳枝稷是重要的新型生物能源植物，已经成为基因转化的主要目标之一。其中，采用转基因技术增强柳枝稷的抗逆性，提高光合效率，增加生物学产量，降低木质素含量和提高乙醇产率等方面已成为目前的研究热点并展示出良好的应用前景。

农杆菌介导的基因转化系统因其具有转化的外源DNA结构完整、遗传稳定、拷贝数低、转化的DNA片段较大等优点，已经成为目前大多数植物遗传转化的首选方法。在国际上报道获得的柳枝稷转基因植物中，也是采用农杆菌介导方法完成的。

与其他植物的遗传转化相似，采用农杆菌介导法转化柳枝稷也存在对组织培养技术依赖性强，转化周期长，存在基因型限制(目前柳枝稷转化成功的仅为个别基因型)，可再生细胞部位与转化感受态细胞不一致等缺点，使其在目前通过组织培养技术较难大量获得胚性愈伤组织的柳枝稷上的普遍应用受到很大限制。探索一种既能利用农杆菌介导体系的优点，又避开以愈伤组织作为转化受体的遗传转化方法，对柳枝稷的基因转化研究将起到很大的促进作用。

发明内容

针对上述现有柳枝稷转基因技术存在的问题或不足，本发明的目的在于，提供一种获得柳枝稷转基因植株的方法，该方法以萌动的种子为转化受体，采用农杆菌介导法转化获得柳枝稷转基因植株，以简化柳枝稷的遗传转化程序，缩短转化周期，拓宽遗传转化的基因型范围。

为了实现上述任务，本发明采用如下的技术方案：

一种获得柳枝稷转基因植株的方法，其特征在于，该方法以萌动的种子为转化受体，采用农杆菌介导法转化获得柳枝稷转基因植株，具体按如下步骤进行：

步骤一：种子的灭菌

取柳枝稷的成熟种子，用3％浓度的次氯酸钙进行灭菌，4℃条件下暗培养12小时，再用3％的次氯酸钙二次灭菌；

步骤二：种子的萌动

将种子在无菌滤纸上，24℃条件下，暗培养至种子萌动；

步骤三：农杆菌转化和共培养

挑取农杆菌的一单克隆于含有卡那霉素和利福平的LB培养基中，在28℃条件下，以200rpm/分钟～250rpm/分钟培养1～2天，至农杆菌菌株浓度为OD₆₀₀＝0.8～1.0，所述的LB培养基为：10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，pH为7.0；

在LB培养基中加入乙酰丁香酮继续培养1小时～2小时，然后转入无菌的50mL离心管中，常温下，3500rpm/分钟，离心15分钟收集农杆菌，以液体MBP培养基重新悬浮农杆菌，调节农杆菌菌株浓度为OD₆₀₀＝0.5，其中，液体MBP培养基为：MS无机盐和维生素的混合合成物：4.43g/L、麦芽糖：30g/L、6-苄基氨基嘌呤：3mg/L，pH＝5.8；

沿种子中部横向劈开，弃去不含胚根的半粒种子，加入悬浮好的农杆菌菌液，同时加入50μl100mM乙酰丁香酮，在真空台上抽真空60～90分钟后，常温下，50rpm/分钟～60rpm/分钟培养60～90分钟；

弃去全部农杆菌菌液，用无菌滤纸吸去种子表面残留的菌液，然后将种子转入培养基MBP，在20℃～24℃条件下，暗培养2～3天，其中，MBP培养基为：MS无机盐和维生素的混合合成物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-苄基氨基嘌呤3mg/L、琼脂粉7.5g/L，pH＝5.8；

步骤四：抗性苗的筛选

将种子依次转入筛选培养基SMBP1，SMBP2和SMBP3，24℃条件下，依次光照培养2～3星期，获得抗性苗；其中，筛选培养基SMBP1为：MS无机盐和维生素的混合合成物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-苄基氨基嘌呤3mg/L、潮霉素100mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，pH＝5.8；筛选培养基SMBP2为：MS无机盐和维生素的混合合成物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-苄基氨基嘌呤3mg/L、潮霉素75mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，pH＝5.8；筛选培养基SMBP3为：MS无机盐和维生素的混合合成物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-苄基氨基嘌呤3mg/L、潮霉素50mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，pH＝5.8；    

步骤五：抗性苗的生根培养