[发明专利]一种获得柳枝稷转基因植株的方法

权利要求书

1.一种获得柳枝稷转基因植株的方法，其特征在于，该方法以萌动的种子为转化受体，采用农杆菌介导法转化获得柳枝稷转基因植株，具体按如下步骤进行：

步骤一：种子的灭菌

取柳枝稷的成熟种子，用3％浓度的次氯酸钙进行灭菌，其中次氯酸钙中加入0.1％的吐温80，4℃条件下暗培养12小时，再用3％的次氯酸钙二次灭菌；

步骤二：种子的萌动

将种子在无菌滤纸上，24℃条件下，暗培养至种子萌动；

步骤三：农杆菌转化和共培养

挑取农杆菌的一单克隆于含有卡那霉素和利福平的LB培养基中，在28℃条件下，以200rpm/分钟～250rpm/分钟培养1～2天，至农杆菌菌株浓度为OD₆₀₀＝0.8～1.0，LB培养基为：10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，pH为7.0；

在LB培养基中加入乙酰丁香酮继续培养1小时～2小时，然后转入无菌的50mL离心管中，常温下，以3500rpm/分钟离心15分钟收集农杆菌，以液体MBP培养基重新悬浮农杆菌，调节农杆菌菌株浓度为OD₆₀₀＝0.5，其中，液体MBP培养基为：MS无机盐和维生素的混合合成物：4.43g/L、麦芽糖：30g/L、6-苄基氨基嘌呤：3mg/L、pH＝5.8；

沿种子中部横向劈开，弃去不含胚根的半粒种子，加入悬浮好的农杆菌菌液，同时加入乙酰丁香酮，在真空台上抽真空60～90分钟后，常温下，以50rpm/分钟～60rpm/分钟培养60～90分钟；

弃去全部农杆菌菌液，用无菌滤纸吸去种子表面残留的菌液，然后将种子转入培养基MBP，在20℃～24℃条件下，暗培养2～3天，其中，MBP培养基为：MS无机盐和维生素的混合合成物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-苄基氨基嘌呤3mg/L、琼脂粉7.5g/L，pH＝5.8；

步骤四：抗性芽的筛选

将种子依次转入筛选培养基SMBP1，SMBP2和SMBP3中，24℃条件下，依次光照培养2～3星期，获得抗性芽；其中，筛选培养基SMBP1为：MS无机盐和维生素的混合合成物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-苄基氨基嘌呤3mg/L、潮霉素100mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，pH＝5.8；筛选培养基SMBP2为：MS无机盐和维生素的混合合成物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-苄基氨基嘌呤3mg/L、潮霉素75mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，pH＝5.8；筛选培养基SMBP3为：MS无机盐和维生素的混合合成物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-苄基氨基嘌呤3mg/L、潮霉素50mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，pH＝5.8；

步骤五：抗性苗的生根培养

在抗性芽生长1cm～2cm高时，转入生根培养基SMO中，28℃，光照条件下培养3～4星期，至幼苗植株高度为5cm以上，其中，生根培养基SMO为：MS无机盐和维生素的混合合成物2.22g/L、蔗糖8g/L、琼脂粉7.0g/L，pH＝5.8；

步骤六：移栽至温室或大田进行分子生物学方法检测

在幼苗植株4～6叶期，取叶片进行PCR和GUS检测，根据前期检测结果，在幼苗植株生长至6-8叶期时，对PCR检测阳性植株进行Southern杂交，获得含有目标基因的转化植株；

步骤七：目的基因表达的转基因植株的获得

根据目的基因表达时期不同，对Southern杂交检测阳性植株在相关时期进行RT-PCR、Nouthern杂交和Western杂交检测，同时根据目标性状，筛选获得目的基因表达的转基因植株。