[发明专利]基因工程酿酒酵母菌活疫苗及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术，具体讲涉及一种以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酿酒酵母菌活疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

在现代水产养殖中，接种疫苗已作为鱼类养殖技术的一个组成部分。疫苗分为灭活疫苗、减毒活疫苗和DNA疫苗。灭活疫苗的制备方法是通过细胞或生物接种，大量扩增和收集病原体，然后以物理或化学方法，在确保免疫活力的情况下，将病原灭活，然后作为抗原刺激机体产生抗体。减毒活疫苗是将病原体在各种条件下通过物理化学诱变产生的减毒株。这两种疫苗在人类和家禽动物中已经大规模的使用，因为需要培养大量的病原菌，所以存在潜在的危险。DNA疫苗是将编码保护性抗原蛋白的基因构建成真核表达质粒，直接导入动物组织细胞，使抗原蛋白经过内源性表达递呈给免疫系统，诱发机体产生特异的体液免疫和细胞免疫。DNA疫苗有许多优点，但也有许多缺点，如克隆的基因能否在动物组织中表达，必须通过人工方法给动物注射DNA疫苗，费时费力且易造成动物损伤，必须培养大量含有重组质粒的大肠杆菌并从中提取重组质粒，还得使用佐剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酿酒酵母菌活疫苗及其制备方法和应用，它能用来免疫水产养殖鱼类，从而保护养殖鱼类免受病原菌哈维氏弧菌的感染。

一种以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酿酒酵母菌活疫苗，其特征在于它是含有哈维氏弧菌溶血素基因的质粒pYD1-1的酿酒酵母工程菌EBY100，所述的酿酒酵母工程菌的表面有哈维氏弧菌的溶血素蛋白。

上述以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酵母菌活疫苗的制备方法，包括分离病原哈维氏弧菌，从病原哈维氏弧菌基因组中克隆出溶血素基因，其特征在于构建溶血素基因表达载体，再将该基因表达载体转化酿酒酵母菌，然后发酵生产基因工程酿酒酵母菌活疫苗。

上述以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酿酒酵母菌活疫苗在海水养殖鱼类免疫中的应用。

本发明的基因工程酿酒酵母菌活疫苗的优点在于，可以克服现有疫苗的许多缺点，如没有减毒疫苗的物理化学处理过程和回复突变的危险，不需要大量培养病原菌，不需要在动物组织中表达，不必使用佐剂，而且，所用的酿酒酵母菌非常安全，培养方法简单易行，经济价廉，便于大规模生产，酿酒酵母菌除了作为疫苗以外，其本身可以为动物提供营养成分。

具体实施方式

1分离病原哈维氏弧菌

本发明采用的2216E培养基平板含有蛋白胨0.5％(重量百分数，下同)、酵母粉0.1％、磷酸铁0.01％、琼脂2.0％、其余为陈海水，pH7.6；用无菌操作法取患病花鲈病灶部位的组织，用无菌匀浆器将该组织匀浆，用无菌生理盐水对组织匀浆进行10倍系列稀释，以平板稀释涂布法在2216E培养基平板上进行平板涂布，在25-30℃下培养24-48h后，挑取优势菌种，在2216E培养基平板上划线纯化，即得到病原哈维氏弧菌。将纯化后的菌种置于含有12.0-15.0％(体积百分数)甘油的生理盐水(0.85％NaCl水溶液)中，并保存于-80℃的冷冻箱中备用。对分离出的菌种进行了64项形态、生理生化特征鉴定，鉴定结果为该菌种为病原哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。通过感染实验确定，该菌种对花鲈有致病性。

上述2216E培养基平板可以含有蛋白胨0.1-2.5％、酵母粉0.05-0.4％、磷酸铁0.005-0.1％、琼脂1.5-3.0％，pH值为6.8-8.6。

2从病原哈维氏弧菌基因组中克隆出溶血素基因

1)哈维氏弧菌DNA模板的制备：将上述哈维氏弧菌接种于2216E培养基平板上，在28℃下培养过夜，将单菌落悬浮于50μl无菌蒸馏水中，于100℃下水浴5min，离心，取上清液作为哈维氏弧菌的DNA模板。

2)引物设计：按照GenBank中哈维氏弧菌溶血素基因序列(登录号为AF293430)与质粒载体pYD1上的多克隆位点，设计如下两条引物，并在上、下游引物的两端分别添加BamH1和EcoR1两种限制性内切酶位点，进行PCR扩增。

上游引物A 5′-CGCGGATCCATGAATAAAACTATTACGTTACT-3′，

下游引物B 5′-CCGGAATTCGAAAGGATGGTTTGACAAT-3′，上、下游引物的下划线上的碱基序列分别为BamH1和EcoR1两种限制性内切酶位点。

3)PCR扩增