[发明专利]基因工程酿酒酵母菌活疫苗及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酿酒酵母菌活疫苗，其特征在于它是含有哈维氏弧菌溶血素基因的质粒pYD1-1的酿酒酵母工程菌EBY100，所述的酿酒酵母工程菌的表面有哈维氏弧菌的溶血素蛋白。

2.权利要求1所述的以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酵母菌活疫苗的制备方法，包括分离病原哈维氏弧菌，从病原哈维氏弧菌基因组中克隆出溶血素基因，其特征在于构建溶血素基因表达载体，再将该表达载体转化酿酒酵母菌，然后发酵生产基因工程酿酒酵母菌活疫苗。

3.权利要求1所述的以酿酒酵母菌为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程酿酒酵母菌活疫苗在海水养殖鱼类免疫中的应用。

4.权利要求1所述的基因工程酿酒酵母菌活疫苗的菌种的编号为酿酒酵母菌EBY100 pYD1-1，该菌种保藏号为CGMCC No.2007，保藏日期为2007年4月16日，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、地址为中国科学院微生物研究所。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于构建所述的溶血素基因表达载体时，先用BamH1和EcoR1两种限制性内切酶将PCR产物与pYD1空载体分别双酶切，然后将纯化的PCR产物与线形pYD1空载体连接，再将连接产物转化入感受态大肠杆菌TOP10，挑取转化子，筛选带有插入目的基因的阳性克隆，最后从获得的阳性转化子中提取带有插入溶血素基因的目的质粒，即得溶血素基因表达载体。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于将所述的表达载体转化入酿酒酵母菌时，先将提纯的阳性质粒pYD1-1转化入EBY100菌株的感受态细胞，再将转化产物涂布在YNB选择培养基上于25-35℃下培养24-48h，挑取长出的单菌落，用酵母菌落PCR的方法筛选阳性转化子，含表达质粒的转化子即为基因工程酿酒酵母菌活疫苗酵母菌种。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于发酵生产所述的基因工程酿酒酵母菌活疫苗时，先将所述的基因工程酿酒酵母菌活疫苗菌种接种于含1.0-2.0％葡萄糖的YNB-CAA的培养基中，在25-35℃下振荡培养过夜，使其菌悬液OD_600nm值介于2到5之间，再用PBS缓冲液洗涤，使菌体在生理盐水中悬浮，把悬浮在生理盐水的菌体接入含D-半乳糖的YNB-CAA液体培养基中，在20℃-25℃下诱导培养36-48小时，将所得的培养物在4-6℃下用PBS缓冲液离心洗涤，重新悬于PBS缓冲液，即得基因工程酿酒酵母菌活疫苗。