[发明专利]一种基于微流控芯片的单细胞内涵物分析方法

说明书

技术领域：

本发明主要涉及在十字型经过涂层无电渗流的PDMS芯片上简单地实现高通量细胞内涵物分析的方法。

背景技术：

传统的分析细胞内涵物方法以大量细胞为前提，获取某一内涵物(例如蛋白质，核酸等)含量的总值，由该值与细胞数量的比值外推至单细胞内该物质的含量。对于性质相对均一的细胞群来说，此方法可以接受；但在另外一些场合下，如某些重大疾病的早期阶段，仅有个别细胞的组分发生变化，这时传统的方法将会平均掉该特异变化。因此，单个细胞层面的分析有助于疾病的早期诊断。此外，与传统的方法相比，单细胞分析在信息的获取上相对准确，能检测活性周期较短的不稳定中间产物。

从技术角度来看，单个细胞的分析可以分为完整的单细胞分析和破碎的单细胞分析。本发明仅涉及到后一种技术。在该技术中影响单细胞分析的一个瓶颈问题是如何快速、有效裂解细胞。目前用于芯片的细胞裂解的方法主要有化学试剂融膜法、Tesla线圈融膜法[文献J.chromatogr.B：Biomed.Appl.1996.677，233-240]、脉冲激光融膜法[Anal.Chem.1998.70，4570-4577]、超声融膜法[Anal.Chem.2000，72，318-322]以及脉冲交变电压法[Anal.Chem.2003，75，5646-5655]等，但这些方法大多仪器设备昂贵，操作复杂，很难与后续的电泳分离检测耦联，通量低等。目前文献已经报道的基于微流控芯片的在线快速细胞融膜方法主要有Ramsey等报道的脉冲交流电叠加直流电的方法快速细胞融膜法[Anal.Chem.2003，75，5646-5655]，以及方肇伦等报道的通过几组低电压的切换将细胞沉积在通道壁上，然后结合高PH值缓冲液和高电压的快速细胞融膜法[Lab on a Chip.2004，4，47-52]。在细胞融膜法中化学试剂法(最常用的是SDS)是最简单的，不需要其它设备。目前已有文献报道微流控芯片SDS裂解细胞[Electrophoresis，2000，21，767-773.；Electrophoresis，2005，26，3689-3696；Proceedings of the Ieee，2004，92，115-125；J Chromatogr A，2006，1117，228-233]，其裂解时间为2～30s；而对于细胞内酶控制的反应其反应分子浓度会在小于1s内发生1个数量级以上变化[Nature，1993，361，315-325]，主要是由于激酶和磷酸酯酶将细胞外信号传导入细胞内激发这类酶控制的反应，对于检测这类信号传导过程中反应分子的浓度，就需要在1s内快速裂解细胞并阻止反应发生。虽然脉冲激光法和脉冲交变电压的方法能快速裂解细胞，但这两种方法都需要复杂昂贵的设备，且操作比较繁琐，需要实时观察，分析通量低等。本发明在简单的十字型PDMS芯片上经过环氧聚合物涂层修饰的方法[Dapeng Wu，Jianhua Qin and Bingcheng Lin；Lab ona chi Advance Articles DOI：10.1039/b708877a]完全抑止电渗流的情况下，细胞在微通道内能被0.2％SDS在500ms左右快速裂解。而细胞在有电渗流存在的微通道中，20～30s也并完全裂解。通过染料分子模拟SDS分子在有无电渗流的微通道中的分布的情况，发现细胞快速裂解的主要原因是：在有电渗流存在时，分离通道中的荧光强度立刻减弱即背景缓冲液中的SDS分子随着电渗流快速整体前移，很少SDS分子扩散到细胞周围；而在无电渗流存在时，分离通道中的荧光强度逐渐减弱，SDS分子在细胞周围的浓度比较高，造成细胞快速裂解。基于这种简单、快速、高效的SDS细胞裂解，结合激光诱导荧光的高灵敏度检测，本发明测得了K562细胞内的谷光苷肽和罗丹明123。在细胞浓度5×10⁶cells/mL下，其分析通量可达到每分钟8～15个细胞。

发明内容：

本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的单细胞内涵物分析方法，该方法可以简单、快速、高通量地分析单细胞内涵物。

本发明提供了一种使用微流控芯片简单、快速、高通量的单细胞内涵物分析方法；

所述的微流控芯片为十字型聚二甲基硅氧烷PDMS芯片，由细胞池、空池、缓冲池、废液池构成；

方法过程为：

将十字型PDMS芯片放入等离子体中进行等离子化处理，然后快速取出不可逆封接，加入环氧聚合物涂层液，室温静置10～30分钟，抽干后放入80～120℃烘箱10～30分钟，然后水洗保存备用；