[发明专利]一种扩增造血干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种三维条件下扩增造血干细胞的方法。具体地说是制备微囊化单个核细胞，利用微胶囊及微囊化材料自身的理化性质促进基质细胞生成，实现造血干细胞与同源基质细胞三维共培养，基质细胞同时分泌细胞外基质和细胞因子，在微胶囊内共同构成类造血微环境，在仅用少量细胞因子的情况下，抑制/延缓造血干细胞走向分化，并实现造血干细胞的有效扩增。

背景技术

造血干细胞在临床上有广泛的应用前景，它在血液系统疾病、实体瘤、免疫缺陷病、遗传性疾病、自身免疫性疾病等的支持治疗、免疫治疗、替代治疗及基因治疗中具有广泛的用途。但造血干细胞移植在实际应用中存在数量限制的问题，需要有效扩增。目前，模拟体内造血微环境已经被认为是体外扩增造血干细胞的最佳方法之一。

造血微环境是由基质细胞、基质细胞分泌的细胞外基质和细胞因子构成的三维空间。体外模拟造血微环境的方法包括：(1)在三维支架上培养造血细胞；(2)与基质细胞共培养；(3)添加造血细胞因子。但上述途径分别存在如下问题：(1)培养规模难以放大，不能满足临床使用要求；(2)异源性基质细胞及建系的基质细胞与造血干细胞共培养，可能存在免疫排斥问题，而同源基质细胞的制备过程繁琐，需要较长时间；(3)单用细胞因子不能维持体外长期造血，而且细胞因子用量大，费用昂贵，大大限制了造血干细胞的大规模扩增。因此，需要发展一种三维培养体系，不但能免除同源基质细胞的制备过程，而且仅需少量细胞因子就能有效扩增造血干细胞。

基于造血干细胞的不对称分裂原则，起始培养细胞中尽可能多的保留造血干细胞是体外扩增的关键。而造血干细胞从单个核细胞中分离、纯化时不可避免的会发生部分丢失，且高度纯化的造血干细胞完全丢失其他辅助细胞，不仅导致增殖能力的降低，移植物抗白血病及移植物抗宿主效应也会发生变化。因此，为扩增出更多、更原始的造血干细胞，以单个核细胞为起始培养细胞是最佳的选择。

本专利提出：以海藻酸钠-壳聚糖(alginate-chitosan，AC)为复合材料、根据单个核细胞来源及初始单个核细胞中CD34⁺细胞数量确定制备工艺及材料选择，制备微囊化单个核细胞，并利用微胶囊膜对生物分子的选择性通透作用、海藻酸钠的理化性质和微胶囊内的渗透压胁迫等微环境，促进基质细胞生成，实现造血干细胞与同源基质细胞的三维共培养。由于微胶囊膜的截留特性，基质细胞分泌的细胞外基质将聚集在微胶囊内，细胞因子在微胶囊内也会实现暂态高浓度，这样就可以少用或不用细胞因子实现造血干细胞的有效扩增。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、成本低廉、可规模化的造血干细胞体外扩增方法，其将在血液生物学和临床应用研究中发挥重要作用。该方法可以利用微胶囊的特定理化性质模拟造血微环境，实现造血干细胞与多种细胞(如：基质细胞、转基因细胞)三维共培养，有效扩增造血干细胞。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种扩增造血干细胞的方法，以海藻酸钠、壳聚糖为复合材料，采用挤出/外部凝胶化法制备AC微囊化单个核细胞；将微囊化单个核细胞加入到扩增培养基中，置37℃、空气中含体积5％CO₂的培养箱中培养，每2-3天定期更换培养基，即为造血干细胞扩增体系。

具体为：

1)单个核细胞的分离：采用密度梯度离心法，用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心分离脐血或骨髓中的单个核细胞；其中含有总细胞个数0.7-3.1％的CD34⁺细胞；

2)微囊化单个核细胞的制备：

A.将β-L-古洛糖醛酸重量含量30-40％、α-D-甘露糖醛酸重量含量为60-70％的海藻酸钠配制成1.0-3.0％w/v海藻酸钠溶液I；

将β-L-古洛糖醛酸重量含量60-70％、α-D-甘露糖醛酸重量含量为30-40％的海藻酸钠配制成0.8-2.5％w/v海藻酸钠溶液II；

将海藻酸钠溶液I和海藻酸钠溶液II按1∶5-5∶1体积比例混合，得海藻酸钠溶液III；

B.将单个核细胞重悬于海藻酸钠溶液III中，每ml溶液中含有细胞8×10⁵-2×10⁷个；

C.采用挤出/外部凝胶化法将海藻酸钠细胞悬液加入pH＝7.0-7.4质量浓度0.8-1.6％氯化钙的水溶液中，获得直径大小在300-500μm之间的海藻酸钙胶珠；