[发明专利]一种扩增造血干细胞的方法

权利要求书

1.一种扩增造血干细胞的方法，其特征在于：以海藻酸钠、壳聚糖为复合材料，采用挤出/外部凝胶化法制备AC微囊化单个核细胞；将微囊化单个核细胞加入到扩增培养基中，置37℃、空气中含体积5％CO₂的培养箱中培养，每2-3天定期更换培养基，即为造血干细胞扩增体系；

具体步骤如下，

1)单个核细胞的分离：用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心分离脐血或骨髓中的单个核细胞；

2)微囊化单个核细胞的制备：

A.将β-L-古洛糖醛酸重量含量30-40％、α-D-甘露糖醛酸重量含量60-70％的海藻酸钠配制成1.0-3.0％w/v海藻酸钠溶液I；

将β-L-古洛糖醛酸重量含量60-70％、α-D-甘露糖醛酸重量含量30-40％的海藻酸钠配制成0.8-2.5％w/v海藻酸钠溶液II；

将海藻酸钠溶液I和海藻酸钠溶液II按1∶5-5∶1体积比例混合，得海藻酸钠溶液III；

将单个核细胞均匀重悬于海藻酸钠溶液III中，每ml溶液中含有细胞8×10⁵-2×10⁷个；

B.采用挤出/外部凝胶化法将海藻酸钠细胞重悬液加入pH＝7.0-7.4、质量浓度0.8-1.6％氯化钙的水溶液中，静置10-30分钟，获得直径大小在300-500μm之间的海藻酸钙凝胶珠；

将海藻酸钙凝胶珠与壳聚糖溶液反应成膜，海藻酸钙胶珠与壳聚糖溶液的体积比为1∶8-14，壳聚糖的分子量40-230KDa、脱乙酰度80-94％、w/v浓度0.3-0.8％，反应成膜时间为5-20min，膜厚在5-50μm范围内，形成非液化的海藻酸钠/壳聚糖微胶囊；

将10-100μM柠檬酸钠溶液按体积比8-14∶1加入非液化的微胶囊中，静置3-8分钟，得到海藻酸钠/壳聚糖半透膜包封的内部为液态环境的液化微胶囊；

3)将微胶囊按体积比1∶8-15置于扩增培养基中，扩增培养基为于IMDM培养液中添加：2-5ng/ml白介素-3，15-25ng/ml干细胞因子，5-10ng/mlFLT-3配体，1.2-2.5ng/ml血小板生成因子，终体积浓度10％胎牛血清，pH＝7.0-7.4。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

当所述挤出/外部凝胶化法为静电液滴发生法时，通过控制微胶囊制备仪的操作条件来调整微胶囊粒径，其操作条件为：电压40-85v、频率100-160Hz、泵速5-16ml/小时、针头孔径4-8#。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述单个核细胞为人脐血、人骨髓或鼠骨髓中的单个核细胞。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养时间5-15天，培养基的组成根据所选定的单个核细胞确定。