[发明专利]检测烟草病毒系列免疫胶体金试剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用免疫胶体金方法检测烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y病毒(PVY)的试剂及其制备方法。

背景技术

烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)，是危害烟草的一种重要的植物病毒，其寄主范围很广.至少可以侵染30个种的199种植物.潜在的可以侵染的植物种类更广。其发生遍及各烟区，不仅造成烟草产量的损失，而且使烟草品质严重下降，特别是中上等烟比例和内在质量下降，经济损失严重。但现在还没有根治的药剂问世，因此建立快速检测病毒的程序，找出发病株，进行人为毁灭或隔离，已成为防止病毒病进一步传播、扩散的行之有效的措施之一。黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y病毒(PVY)也是对植物具有严重危害性的病毒。

目前对烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y病毒(PVY)的检测方法主要包括生物学鉴定、酶联免疫吸附法、RT-PCR法。

1、生物学鉴定是一种十分准确和可靠的方法，但也存在如下缺点：(1)不同病毒和不同的寄主，需要采用一些特殊的接种措施才能成功，技术要求难度较高；(2)整个鉴定过程周期太长，比如接种后症状表现的时间较长，一般要3天以上，有些寄主症状表现需要20至24天；(3)接种后症状的表现还受外界环境因素影响；(4)需要经过专业培训的技术人员操作，操作人员要有丰富的相关经验，还需了解生物鉴定的各种干扰因素，了解和判断生物症状的正确与否，才能获得可靠的分析结果；(5)虽不需要贵重的仪器设备，但需要相对独立和洁净的植物培养空间，以避免不同病毒之间感染。

2、酶联免疫吸附法是以间接ELISA或则双抗夹心ELISA为检测原理，以双抗夹心法为例，其是以烟草花叶病毒抗体包被酶标板，检测时将被检测样品加入酶标板，反应后用再加入酶标二抗，最后通过显色测OD值。存在的缺点是：(1)需要专门的仪器设备如酶标仪来配合使用，不利于在基层单位进行推广和使用；(2)检测操作人员需要经过专业培训；(3)操作过程相对比较复杂，检测所需时间比较长，全程需要4h-8h；(4)检测所需费用较高，不能实现单个样品检测。

3、RT-PCR法是以PCR技术为基础，直接对病毒的核酸序列进行检测.RT-PCR法以该病毒衣壳病毒基因作为引物模板，合成一由20个碱基对组成的引物。然后对病毒核苷酸进行扩增，以反应体系中是否产生这种扩增产物来判断样品中是否存在该病毒。所以这种方法灵敏度较前述方法均有很大程度的提高，灵敏度可达10fg.所需样品量少，适合于检测低含量样品，但同时RT-PCR法也存在如下缺点：(1)需要专门的仪器设备如PCR仪配合使用，不利于在基层单位进行推广和使用；(2)实验要求相对比较严格，检测操作人员需要经过专业培训；(3)操作过程相对比较复杂，全程需要3h-5h；(4)检测所需费用较高，不能实现单个样品检测。

发明内容

本发明的任务是解决上述存在原如检测时间长、不能现场检测、检测费用高等缺点，提供一种特异性强、敏感性高、简易快速、费用低廉、能现场检测的适用于烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y病毒(PVY)的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法。

本发明的检测烟草病毒系列免疫胶体金试剂的制备方法包括检测TMV病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法、检测CMV病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法和检测PVY病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法。

1、检测TMV病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)多克隆抗体：取纯化的烟草花叶病毒注射兔子，采血，取血清，提纯抗体IgG，纯度＞95％；

(2)胶体金：将100ml 0.01％氯化金用2-3ml的1％柠檬酸三钠还原成15nm-40nm的颗粒溶液；

(3)TMV免疫胶体金溶液：用0.1mol/L K₂CO₃将胶体金溶液的pH值调至7-8，将胶体金溶液按100ml胶体金溶液中加入0.5mg-2mg步骤(1)的TMV多克隆抗体，混合均匀，得TMV免疫胶体金溶液；

(4)将上述的TMV免疫胶体金溶液点到玻璃纤维上，形成TMV胶体金；

(5)将TMV多克隆抗体溶液和羊抗兔多克隆抗体，分别点在硝酸纤维膜的不同位置上；滴有TMV多克隆抗体的称为TMV多克隆抗体显示区，滴有羊抗兔多克隆抗体的位置称为质控线显示区；所述羊抗兔多克隆抗体可于商店购买；

(6)将滤样纸、胶体金、硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴到一张不干胶的胶板上，然后切割成试纸条；