[发明专利]用于鉴定病原体的寡核苷酸微阵列

说明书

本申请要求于2005年12月30日提交的美国临时专利申请 60/755,504的权益。

发明背景

本发明涉及用于检测检验样品中病原体存在情况的检验试剂盒 和方法。检验样品可以获自患者或者来自可能含有病原体的食物或饮 料的来源。

诸如脑炎、脑膜炎、脑(脊)膜炎、肺炎、肠胃炎、心内膜炎、尿 道感染的疾病由病原体感染引起。病原体包括不同的细菌、病毒、真 菌和原生动物。不同的致病性感染往往具有类似的症状，这致使难以 提供感染或疾病的起因的确诊。例如，脑炎和脑(脊)膜炎患者一般都 会出现发烧、头痛和惊厥。快速而准确地鉴定引起这些症状的病原体 对于确定开出什么药方至关重要。当前用于鉴定病原体的诊断方法包 括：镜检、微生物培养、血清免疫测试和聚合酶链式反应(PCR)。这 些方法需要经过严格训练的人员而且非常费时。

按照常规的PCR方法，将含有起模板作用的基因的检验样品与设 计成用于扩增具有特定长度的至少一种基因的至少一对PCR引物混 合。通过使所扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并使其染色，就可 使PCR产物显现。按照PCR方法，根据所显现的PCR产物长度来鉴 定检验样品中所含的基因。在同一样品中可以扩增多对引物以便更有 效地筛选多种基因。

然而，随着引物试剂中所含PCR引物的数量增多，在电泳凝胶上 的“噪声”也随之增多。当由于非特异性退火产生PCR产物时，“噪 声”就会出现。出于此原因，当使用PCR反应时，难以确定不只是仅 少数基因存在。

此外，有必要设计好引物，以使经PCR反应扩增出的PCR产物 在分辨率有限的电泳凝胶上可以辨别。要设计出可产生适当的可分辨 PCR产物且噪声低的引物并不容易并且耗时。因此，严格的基于PCR/ 电泳的方法对于筛选大量基因表达是低效的。

发明概述

本发明涉及用于检测生物样品或检验样品中的目标核酸的方法 和检验试剂盒。使用寡核苷酸微阵列快速地高通量筛选病原体的存在 情况。寡核苷酸微阵列含有已知病原体的各种聚核苷酸(探针)，并且 以一个杂交测定来鉴别病原体。

一方面，本发明涉及一种简易而快速地确定生物样品或检验样品 中是否存在含有目标核酸的多核苷酸的方法。

另一方面，本发明涉及一种用于检测生物样品或检验样品中病原 体的目标核酸的方法，所述方法包括：利用与不止一种病原体中的保 守区结合的一对或更多对引物来扩增样品中的目标核酸；使扩增的目 标核酸与寡核苷酸微阵列接触；且检测目标核酸与探针的结合情况， 其中与特定病原体探针结合则表明样品中存在该病原体。所述微阵列 包括含与不同病原体互补的多核苷酸序列的两种或以上的探针或者 探针组。

又一方面，本发明涉及一种辨别样品中的大肠杆菌(E.coli)和沙门 氏菌的方法。所述方法包括：利用与大肠杆菌和沙门氏菌中的保守区 结合的一对或更多对引物扩增样品中的核酸；使扩增的目标核酸与寡 核苷酸微阵列接触；且检测核酸与作为指示样品中存在大肠杆菌和/ 或沙门氏菌的探针的结合情况。所述微阵列包括含与大肠杆菌和沙门 氏菌中的可变区互补的多核苷酸序列的两种或以上探针。

在另一方面，本发明涉及一种用于检测在生物样品或检验样品中 病原体的目标核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：至少一对引物和寡核 苷酸微阵列，所述微阵列包含固定化在固相支持体上的至少一种探 针。

根据以下的说明且结合附图，并通过例示阐明本发明原理，本发 明的其他方面和优点将显而易见。

附图简述

图1A和图1B显示了16S rDNA的细菌DNA序列的保守引物区 和可变探针区。

图2A和图2B显示了18S rDNA的真菌DNA序列的保守引物区 和可变探针区。

图3是本发明实施方案的图式概述。

发明详述

1.病原体