[发明专利]用于区分至少两个细胞群体的方法及其应用

说明书

本发明涉及通过使用流式细胞术的原理来检测、区分和计数存在于液体中的生物成分(éléments biologiques)的方法，所述方法可适用于在血液学中常规使用的装置。 

目前市场上销售的自动血液学分析仪(血液学自动装置)提供了越来越多的能够分析和分类被分析的成分的可能性。 

已广泛用于流式细胞术的荧光测量法主要用于通过免疫表型分型(immunophénotypage)对成分进行分类。在常规使用的血液学自动装置中，其尤其专门用于检测体外活体染料，所述体外活体染料用作用于定量核酸或其他细胞组分的分子探针。 

免疫探针在常规血液学中的应用仍未普遍化，尽管在不同的制造者中，通过少数胚胎试验已看到其的应用前景。 

例如，BAYER公司(Bayer Diagnostics，Tarrytown，New York，USA)(通过BAYER-TECHNICON H*1)首次提出在淋巴细胞分型中使用抗体的混合物来确定不同类型的淋巴细胞。在该情况下，不是通过荧光而是通过测量由对生物素(其本身偶联至抗体)具有高亲和力的抗生物素蛋白-过氧化物酶化合物所产生的光吸收来进行抗原表达的测量。所述抗体对于表面分子(CD4、CD8、CD2、CD19)的靶抗原来说是特异性的，所述表面分子特异于所表征的细胞类型。 

ABBOTT公司(Abbott Laboratories，Abbott Park，Illinois，USA)的ABBOTT CD4000提出了使用2种荧光波长进行分析，以便尤其用于实施免疫表型分型。Abbott Laboratorie s公司的专利WO98/02727描述了这种类型的装置，从而使得能够使用抗体对全血样品进行标记。ABBOTT在该专利中详细描述了用于对全血样品实现抗体-抗原反应的装置。 

简单、快速、有效且特异的表型分型方法必须能够在血液学自动 装置类型的非常简单的自动装置中使用，从而使得能够使用有限数目的检测器进行工作。即使技术学基本上相同，但血液学中常规使用的自动装置具有与流式细胞仪不同的特征，特别是在测量参数的数目方面不同，所述测量参数的数目被减少至必需的最低限度，特别是在常规测量中。此外，由于成本是个非常重要的限制因素，所以装置和它们所允许进行的分析的简化仅能够提高整体节约。 

流式细胞术是使得能够同时测量相应于生物成分例如细胞或细胞器的不同物理特征的多个参数的技术。在液体流中带动生物成分，并当它们通过光源前面的测量室时该装置记录它们中每一个的行为。 

该技术实际上是3个系统的组合： 

1)流体系统：允许悬浮液中的生物成分在测量室中在光源前面一个接一个地通过的层流； 

2)光学系统：激光束或其他光源以及使得能够选择合适的激发和发射波长的不同滤光片； 

3)电子系统：PMT(光电倍增管)或光电二极管，其捕获所发射出的光，从而允许将其转换至电信号，随后转换至数字信号。 

总之，光源使得能够产生光，所述光将通过透镜和照亮经过测量室的生物成分。在与生物成分接触时，部分光散射。该光通过多个透镜和其他光阑，并聚焦在光电二极管型传感器上，从而产生FSC(前向散射)的测量结果。该测量结果，在所选择的角度范围内，给出了关于生物成分的大小的指示。 

该光的另一部分发生正交偏转，并通过另一组透镜，和一组半反射镜，以在传感器的范围内进行测量，从而产生SSC(侧向散射)信号。该正交光的测量结果给出了关于生物成分的密度和其粒度(结构)的指示。 

最后，可通过与待分析的波长和光信号一样多的光电倍增管或光电二极管来进行光强度的测量。 

在细胞计数器中生物成分的通过事先需要这样的步骤，在所述步骤期间使生物成分可检测从而被对所述生物成分的结构或功能特异的 探针所标记，预先使所述探针本身可被检测。 

当探针的标记物是荧光分子时，后者可吸收在对于其而言特异的波长范围内的光子(激发光谱)。在如此激发后，荧光分子将返回其基态，并释放具有更低能量的光子。因此，荧光分子具有对于其而言特有的激发波长光谱，在所述激发波长光谱中，取决于同样特征性的发射光谱，它将吸收能量从而以荧光的形式(发射的荧光)再发射之。发射的荧光波长总是比激发波长更大(更低的频率)。 

散射信号(FSC，SSC)和荧光信号通过适合的检测器将会被转换成电信号，随后通过计算机系统进行分析。