[发明专利]测量吸附变应原酶的酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及测量疫苗制剂中的一种或多种变应原酶的酶活性，且 从而获得疫苗制剂中的免疫活性的指示和/或变应原酶的量的定量的 体外方法。

发明背景

蛋白质与表面的相互作用是具有生理意义和技术意义的广泛公认 的现象。重要的例子是在过敏症疫苗中蛋白质变应原向佐剂氢氧化铝 的吸附。佐剂是在疫苗接种后通过增强免疫应答起作用的化合物。氢 氧化铝的佐剂效应已得到大量研究并且关于机制的众多理论已被提 出。

用于例如皮下注射的过敏症疫苗可以通过将变应原的水溶液和固 相载体例如氢氧化铝凝胶混合以产生混合物进行制备，其中至少一部 分变应原吸附到固相上，而部分变应原或无变应原在液相中。固相载 体可以充当佐剂，即它增强变应原的免疫应答，尽管增强作用的机制 未必充分了解。同样，变应原向固相载体的吸附机制和性质未必充分 了解，且可能强烈取决于涉及的变应原的类型。然而，理论上，向氢 氧化铝凝胶的吸附部分涉及静电力。对于蛋白质，认为磷酸化蛋白的 磷酸基也与氢氧化铝凝胶相互作用，且可能在某种程度上代替凝胶结 构中的氢氧化物基团。

氢氧化铝的蛋白质吸附能力已用模型蛋白质卵白蛋白(OA)和牛 血清白蛋白(BSA)进行彻底研究。近来，已进行关于蛋白质向氢氧化 铝的吸附的结构影响的研究。发射荧光测量连同差示扫描量热法指出 重大结构改变在OA和BSA向氢氧化铝吸附后发生(Jones等人， Effects of Adsorption to Aluminium Salt Adjuvants on the Structure and Stability of Model Protein Antigens，The Journal off Biological Chemistry，第280卷，第13406-13414页，2005)。 相反另一项研究指出在ELISA实验中氢氧化铝的存在帮助OA维持天然 构象(Houen等人，A Non-denaturing Enzyme Linked Immunosorbent Assay With Protein Preadsorbed Onto Aluminium Hydroxide， Journal of Immunological Methods，第200卷，第99-105页，1997)。 OA在转移至微量滴定板孔的塑料表面前吸附到氢氧化铝上，维持其结 合针对天然形式的OA产生的单克隆抗体的能力。与此相反，未与氢氧 化铝一起预温育的OA与针对热变性的白蛋白产生的单克隆抗体结合。 然而，这些技术未给出关于蛋白质混合物中存在的单个蛋白质的任何 信息。

氢氧化铝对变应原的结构和稳定性的影响从几个角度看来是重要 的。构象表位在吸附期间可能丧失并且免疫原性可能由于经过长时间 段的贮藏而改变。

吸附的程度随所讨论的具体变应原的性质而变。在以生物材料提 取物形式的变应原的情况下，例如草花粉变应原的提取物，该提取物 包含许多不同离子和分子，其潜在地干扰变应原与固相载体的结合。

房尘螨(HDM)屋尘螨(Derma to phagoides pteronyssinus)是 吸入变应原的主要来源。蛋白质变应原Der p1和Der p2视为Der p 变应原中的2种最强力的变应原。Der p1的结构和酶活性已得到充 分表征。几项体外研究暗示Der p1的半胱氨酸蛋白酶活性增强变应 原的效力，例如通过切割肺上皮中的紧密连接蛋白质和切割人B细胞 上的CD23(低亲和力IgE受体)(Jacquet等人，Biochemical and Immunological Characterization of a Recombinant Precursor form of the House Dust Mite Allergen Der p1 produced by Drosophila cells，Clinical and Experimental Allergy，第30卷，第784-793 页，2000)。基于氢氧化铝佐剂的HDM疫苗包含纯化的HDM提取物作 为活性药物成分(API)。