[发明专利]具有提高的稳定性的白细胞介素12p40变体

说明书

发明领域：

本发明总体上涉及IL-12p40蛋白，包括含有IL-12p40的融合蛋白， 所述IL-12p40受到修饰以提高它们的稳定性。具体而言，本发明的 IL-12p40蛋白移除了p40亚单位Lys260和Arg261区域中的蛋白水解部位。

发明背景

白细胞介素12(IL-12)是炎性细胞因子，其通过淋巴系统的多种细胞， 包括吞噬细胞、B细胞和活化的树突状细胞应答感染而产生(Colombo和 Trinchieri(2002)，Cytokine & Growth Factor Reviews，13：155-168)。IL-12 在介导免疫系统的固有免疫和适应性免疫之间的相互作用、作用于T细胞 和天然杀伤(NK)细胞、增强细胞毒性淋巴细胞的增殖和活性以及提高其它 炎性细胞因子特别是干扰素γ(IFN-γ)的产生中起着重要的作用。

IL-12是由α-链(p35亚单位，IL-12p35)和β-链(p40亚单位，IL-12p40) 组成的异源二聚体，所述α-链和β-链通过二硫桥共价连接以形成生物活性 的74kDa异源二聚体。成熟的(野生型)人IL-12的IL-12p35和IL-12p40 的氨基酸序列分别描述于图1(SEQ ID NO：1)和图2(SEQ ID NO：2)。

白细胞介素23(IL-23)是与IL-12密切相关的二硫键桥接的异源二聚体 分子，因为其具有与IL-12相同的β链IL-12p40，但是具有独特的α链(p19 亚单位，IL-23p19)(Oppmann等，(2000)，Immunity，13：715-725)。与IL-12 类似，IL-23是由吞噬细胞和活化的树突状细胞产生的，并且被认为参与 一系列炎性细胞的募集和活化(Langrish等，(2004)Immunol.Rev.，202： 96-105)。成熟的人IL-23的IL-23p19的氨基酸序列描述于图3(SEQ ID NO：3)。

对于免疫细胞分泌生物活性的IL-12或IL-23异源二聚体而言，需要 在相同的细胞中伴随表达α和β亚单位。没有观察到免疫细胞仅分泌 IL-12p35或IL-23p19，但是产生生物活性IL-12或IL-23异源二聚体的细 胞超过异源二聚体10至100倍地分泌游离形式的p40亚单位(D’Andrea等 (1992)，J.Exp.Med.，176：1387-98，Oppmann等，(2000)，Immunity，13： 715-725)。此外，已观察到在小鼠中，甚至在不存在α亚单位的情况下， 细胞也可能产生生物活性的IL-12p40同源二聚体(Hikawa等(2004)， Neuroscience，129：75-83)。

已显示出内源IL-12的存在对于免疫抵抗广泛的病原体以及免疫抵抗 移植和化学诱导的肿瘤是必需的(Gateley等(1998)，Annu.Rev.Immunol.， 16：495-521)。已证明IL-12具有基于诱导IFN-γ和活化效应细胞诸如CD8+ T细胞和NK细胞的有效的抗肿瘤活性(Brunda等(1993)，J.Exp.Med.，178： 1223-30)。作为其经证实的抗肿瘤活性的结果，在人类临床试验中作为用 于治疗多种癌症的免疫治疗剂测试了IL-12(Atkins等(1997)，Clin.Cancer Res.，3：409-17；Gollob等(2000)，Clin.Cancer Res.，6：1678-92；以及 Hurteau等(2001)，Gynecol.Oncol.，82：7-10)，所述癌症包括肾癌、结肠癌、 卵巢癌、黑素瘤和T细胞淋巴瘤，以及作为用于癌症疫苗的佐剂测试了 IL-12(Lee等(2001)，J.Clin.Oncol.19：3836-47)。

对于IL-12或IL-23，产生正确折叠的和生物活性的异源二聚体形式的 重组蛋白需要在生产细胞系中同时表达α亚单位和IL-12p40两者。然而， 纯化的重组蛋白显示出一定程度的异质性，这是由在IL-12p40的C端区 域的蛋白酶剪切所造成的。IL-12或IL-23蛋白的不稳定性可能导致在其生 产和作为治疗剂的临床应用中的问题。因此，本领域需要经改良的重组 IL-12或IL-23变体，所述变体产生对蛋白酶剪切更具抵抗力的同质蛋白。

发明概述