[发明专利]分离的肝脏干细胞

说明书

技术领域

本发明涉及来自成体肝脏的分离的肝脏祖细胞或干细胞，及其在医学、肝病学、肝脏代谢出生缺陷、移植、传染性疾病、肝脏衰竭中的用途。本发明还涉及分离这些细胞的方法、其培养物、分化前后表征、及其在移植、人类疾病的动物模型、人造器官装置、毒理学和药理学中的用途。 

背景技术

肝脏是重要器官，其发挥很多重要的功能，如葡萄糖的体内平衡、异型生物质的(xenobiotic)脱毒或大分子合成。因此，多种肝脏功能之一受损能够对健康产生显著影响。根据世界卫生组织(WHO)，全球急或慢性肝病的发病率使这些疾病成为第五至第九位的致死原因。目前为止，对晚期肝脏疾病的根治方法只有肝脏移植术。经历外科肝脏移植的患者的结局很好，95％以上得以康复。然而，即使有包括肝脏分割和活体肝移植供体在内的新型外科技术，器官的日益紧缺使得等待治疗名单中的死亡率不断攀升。因此，在移植医学研究中的重要目标就是证明肝脏细胞(liver cell)在肝脏再生和肝病治疗中的潜在用途。 

肝脏细胞移植(liver cell transplantation，LCT)是一种新兴方法，涉及在受体肝门系统中输注肝脏细胞悬液。作为移植结果其目的在于恢复受体肝脏功能以及重建(repopulation)患病的肝实质(liverparenchyma)。LCT首先被证实在动物模型中有效，其中已经表明同源肝细胞(hepatocyte)能够长期存活并纠正各种酶缺陷(综述参见Najimi和Sokal.2005.Minerva Pediatr 57(5)：243-57)。 

人类当中，早期研究专门用于治疗急性肝脏衰竭。这些研究促使临床工作者将LCT扩展用于其他适应症，目前为止，全球已经报道有各种缺陷的至少30个案例(Strom等人1997.Transplant Proc 29(4)：2103-6)。在代谢疾病的具体领域中，十三个案例中报告了肝脏细胞用于治疗I型Crigler-Najjar综合征、尿素循环缺陷或罕见疾病如婴儿Refsum病的用途。这些研究证明了肝细胞在肝实质中的植入以及随后在移植后长 达18月患者状况的改善。 

然而，由于用于移植的成熟人类肝脏细胞仍然有限，实际上或多或少和全肝可用性一样受限，研究还意图从其他来源获得可移植的细胞，如来自胚胎或成体来源的祖细胞和干细胞，这些细胞例如可在体外扩增，并且能够尤其是在移植后体内分化成有功能的成熟肝细胞。因此，迫切需要开发出新的在治疗肝脏相关疾病相关的各种疾病或病况中有用的方法，尤其是考虑到目前大多数这些疾病的可用治疗不足时。 

历史上，由于观察到胚胎干(ES)细胞无限克隆分裂以及多能分化成整个组织的子细胞(daughter cell)的能力，其曾被认为仅参与器官发生。另一方面，成体器官中的再生过程典型情况下归因于成体祖细胞。然而，考虑到在成体器官中发现了表达胚胎标志物的干细胞，该理论已被修正。因此，现在描述干细胞和祖细胞特征时不仅基于发育过程(胚胎对成体)还基于特异性细胞标志物的存在。实际上，细胞标志物如膜蛋白或转录因子的表达可随着分化途径有很大变化，它们反映了各种刺激(如环境刺激)和细胞需求。通常在分化过程中，观察到干细胞将逐渐停止展示指示其多能性的标志物如Oct-4，而表达有助于后续阶段的标志物如特定谱系的标志物。作为一个非限定性的实例，Oct-4随着成熟而逐渐丢失，另一方面进入内胚层谱系的细胞开始表达甲胎蛋白。 

就通过细胞移植来进行肝脏再生而言，可以考虑多种可能的来源细胞类型。例如由于ES细胞的多能性，预期其能够再生任何器官。实际上，本领域中这条路已经得到广泛探索。然而，当ES细胞引入子宫(inutero)以外的任何其他组织中时ES细胞倾向于引起肿瘤生长。因此，其体内应用由于致癌风险仍然受到限制。即便之前ES细胞在体外分化成功，用于人类接种都不够安全。 

更加安全的替代方式是使用成体祖细胞，不像ES细胞，其倾向于表现出受限的克隆分裂能力以及分化产生更加有限命运的子细胞。肝脏中，已经描述过成体祖细胞如卵圆细胞(胆管细胞和肝细胞前体)或小肝细胞样细胞。然而，其在正常成体器官中的稀少使得其医学用途变得困难。