[发明专利]分离的肝脏干细胞

权利要求书

1.来源于人成年肝脏的分离的人祖细胞或干细胞，其特征在于

(a)它表达标志物CD90、CD73、CD44、波形蛋白和α-平滑肌肌 动蛋白；

(b)它表达ALB；和

(c)它对CK-19呈阴性。

2.权利要求1的分离的人祖细胞或干细胞，其还表达一个或更多 个其它肝脏或肝细胞标志物，其选自CD29、甲胎蛋白(AFP)、α-1抗 胰蛋白酶、HNF-4和MRP2转运蛋白。

3.权利要求2的分离的人祖细胞或干细胞，其表达CD29、AFP、 α-1抗胰蛋白酶和MRP2转运蛋白。

4.来源于人成体肝脏的分离的人祖细胞或干细胞，其对CD90、 CD29和CD44呈阳性，并且是白蛋白阳性、波形蛋白阳性以及α-平滑 肌肌动蛋白阳性，并且是CD45、CD34、CD117和CK19阴性。

5.权利要求1至4中任一项的分离的人祖细胞或干细胞，其中所 述细胞具有间充质样形态，包括以下任一项或全部：单层生长、扁平形 状、宽细胞质以及具有一或两个核仁的卵形细胞核。

6.权利要求1至4中任一项的分离的人祖细胞或干细胞，其中所 述细胞能分化成肝细胞或肝细胞样细胞，而不分化成中胚层细胞类型。

7.细胞系或细胞群，其包含权利要求1至6中任一项所述的分离 的肝脏祖细胞或干细胞。

8.分离的人成体肝脏祖细胞或干细胞和细胞系，于2006年2月20 日根据布达佩斯条约保藏在比利时微生物合作保藏中心(BCCM)，其 保藏号为LMBP6452CB，及其亚系。

9.权利要求8的分离的人成体肝脏祖细胞或干细胞和细胞系，其 中所述亚系为克隆亚系。

10.获得权利要求1-6中任一项所述分离的人祖细胞或干细胞或者 包含所述祖细胞或干细胞的细胞群的方法，该方法包括：(a)将通过解 离人成体肝脏或其一部分而从所速成体肝脏或其一部分形成的原代细 胞群铺板到细胞能够粘附的基底上，(b)将来自该原代细胞群的已经粘 附到所述基底上的细胞持续培养至少7天，和(c)将步骤(b)的细胞 传代至少一次。

11.权利要求10的方法，其中将来自该原代细胞群的已经粘附到 所述基底上的细胞持续培养至少10天、至少13天或至少15天。

12.权利要求10的方法，其中将步骤(c)的细胞传代至少两次。

13.分离的人成体肝脏祖细胞或干细胞、其细胞系和／或包含所述 细胞的细胞群，其可以用权利要求10的方法获得或者直接由所述方法 获得。

14.权利要求13的分离的人成体肝脏祖细胞或干细胞、其细胞系 和／或包含所述细胞的细胞群，其中所述方法包括：(a)从人对象解离 成体肝脏或其一部分，以从所速成体肝脏或其一部分形成原代细胞群； (b)将所述原代细胞群铺板到Williams Medium E培养基中的包被I 型胶原的基底上，所述培养基包含胎牛血清、EGF、胰岛素和地塞米松； (c)持续24小时使来自所述原代细胞群的细胞粘附到所述基底上，随 后将培养基更换为具有(b)中组成的新鲜培养基；(d)在两周时间中 在(c)中所述培养基中培养细胞；(e)将培养基更换为包含高葡萄糖 和FCS的DMEM，继续培养细胞，由此本发明的祖细胞或干细胞出现 并增殖；(f)使细胞达到约70％汇合，将细胞传代至少一次，其中所述 细胞铺板到(b)中的基底上并在(e)中的培养基中培养。

15.权利要求14的分离的人成体肝脏祖细胞或干细胞、其细胞系 和／或包含所述细胞的细胞群，其中(b)所述培养基包含10％(v／v)的胎 牛血清。

16.权利要求14的分离的人成体肝脏祖细胞或干细胞、其细胞系 和／或包含所述细胞的细胞群，其中(b)所述培养基包含25ng／ml的EGF。