[发明专利]样品上标签的定位方法

说明书

本发明涉及一种分析样品的方法，该方法包括：

·在样品上预备大体上平坦的表面，

·使样品暴露于含有标签的标示试剂，由此将标签引入样品中，

·获得一系列样品图像，

·获得标签在由此所得的每个图像中的相对位置，以及

·由如此所得的相对位置得到标签的相对位置的三维重构。

由电子X线断层摄影术可了解这种方法，例如“电子X线断层摄 影术，采用透射式电子显微镜的三维成像”，编者J.Frank，ISBN 0-306-43995-6中所述，进一步称为J.Frank。在生物学和组织学中，需 要确定某些分子例如蛋白质、抗体和核苷在例如生物样品中的位置， 以得到关于某些过程在例如生物样品中哪里发生并且如何发生的见 识。类似的需要出现在例如聚合物的分析期间。

在电子X线断层摄影术中，在本质上已知的仪器透射式电子显微 镜(TEM)中用电子束照射薄样品，在TEM中电子束的能量通常为80- 300keV。该样品薄得足以使电子束部分穿透它。样品的不同部分显示 出不同的透明度，这是由于无阻碍地通过样品的电子量是与位置有关 的。通过形成一系列图像，其中在各个图像之间该样品是倾斜的(如 此命名的倾斜系列)，并且通过收集来自这一系列图像的数据，可制得 样品的三维重构。

为了成像例如生物组织中的某些结构，可将所谓标签连附到某些 分子上。这些标签的特征在于它们显示出高对比度并且其自身非常特 异性地连附到例如一定类型的抗体，而其自身没有连附到其它类型的 抗体及其它分子。通过检测标签在样品中的位置，于是可确定例如抗 体的存在和定位。

由于通过样品的电子和构成样品的原子之间的相互作用与该原子 的质子数Z非常相关，因此，特别是样品原子组成的局部变化能够这 样成像。由于生物材料包括非常少的高Z原子，因此，尤其贴上含高Z 材料的标签是非常有效的。这种标签可以是含有蛋白质-金络合物的 标签，其中金以金纳米颗粒存在，其典型的直径为1-50nm。这种标 签在市场上可购得，例如来自Nanoprobes Inc.，Yaphank， NY11980-9710，USA的名为NanoGold的标签。

另一种标记方法采用荧光标签。这些标签响应光照射或例如电子 束照射而发出通常具有非常特定波长的荧光。利用光子探测器可探测 到如此发出的光子，由此指示在该位置存在的标签。这种荧光标签的 例子是例如：如此命名的半导体量子点，市售的例如来自Evident Technologies，Troy，NY 12180，USA的名称为EviTag的标签。有机 荧光标签同样也是已知的并且使用广泛，另一种类型的(无机)标签 被描述在例如欧洲申请EP05112781中。

人们注意到预备样品上的平面表面以及使样品与标示试剂相接触 不必按照该顺序进行：很可能首先将标签供给样品，然后预备平坦的 表面，参见“EM中的3-D金原位标记”，P.Gonzalez-Melendi等人， the Plant Journal(2002)Vol.29(2)，第237-243页。

电子X线断层摄影术的缺点是其只能用于非常薄的样品，因为电 子必须通过样品。通常需要小于1μm或甚至小于100nm的厚度，如 J.Frank中第25页图2所示。为了研究例如细胞中的某些结构，进行 调查研究的特征必须存在于样品中。大于样品厚度的结构可因此没有 对其全部进行研究，伴有的风险是待研究的结构在薄样品中完全不见 了。

电子X线断层摄影术的另一缺点是必须制作许多样品图像，导致 撞击到样品上的电子总量高。这种高总量使样品受到损害，如J.Frank 中第3章所述。为了在进行电子X线断层摄影术时将损害减至最小， 因此经常必须设法使这种损害极小化，例如在低剂量条件下工作-导 致图像中信噪比差-和/或将样品冷却到低温度例如液氮点或甚至液氦 点。

本发明目的是提供一种在较厚样品中定位标签的方法，该样品比 现有技术方法中可能的厚度更厚。

为了那个目的，根据本发明的方法的特征在于：

·各个图像在大体上相同的方向上显示所述的样品，以及

·从处于该一系列图像的各连续图像之间的样品中除去表面层， 留下大体上平行于最初形成的平坦表面的新表面层。