[发明专利]DNA模块克隆载体质粒和其应用方法

说明书

相关申请的交叉参考

本申请是部分后续申请，它根据35 U.S.C120要求2003年10月9日提交 的申请号10/682,764的优先权，该申请根据35 U.S.C.119(e)要求2002年10月 9日提交的临时申请60/417,282的优先权。

发明领域

本发明涉及克隆载体质粒领域，并涉及使用克隆载体质粒构建DNA构建 物或转基因。

发明背景

分子生物学的基础是重组DNA技术，在本文中将其小结为出于研究核酸 及其蛋白产物的结构和功能而修饰和扩增核酸。

单个基因、基因调控区、基因亚组和含有它们的整个染色体均由核苷酸的 双链反向平行序列组成，核苷酸包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶，习 惯上分别用首字母A、T、G和C表示。这些DNA序列以及cDNA序列是衍 生自mRNA(信使RNA)分子的双链DNA拷贝，可切割成单独片段，分离和插 入载体如细菌质粒中来研究基因产物。质粒是染色体外的一段DNA，最初来 源于细菌，可进行操作并再次引入宿主细菌中以便研究或产生基因产物。质粒 的DNA与所有染色体DNA相似，即它同样由A、T、G和C核苷酸组成，编 码基因和基因调控区，然而，质粒是相对较小的分子，它由少于约30,000个碱 基对或30千碱基(kb)组成。此外，双链质粒的核苷酸碱基对形成连续的环形分 子，也使质粒DNA区别于染色体DNA。

质粒能促进细菌生物体之间快速交换遗传物质，使得细菌能够快速适应环 境改变，如温度、食物供给或其它刺激。获得的任何质粒必须表达有助于宿主 存活的基因，否则该生物体将破坏或丢弃该质粒，因为维持不必要的质粒会浪 费资源。克隆的细胞群含有相同遗传物质，包括它可能携带的任何质粒。将含 有DNA插入物的克隆载体质粒用于这类克隆的宿主细胞群将扩增可得的感兴 趣DNA的量。然后分离并回收如此克隆的DNA，以便在建立DNA构建物所 需的步骤中进行后续操作。因此，应理解，克隆的载体质粒是研究基因功能的 有用工具，能够快速产生大量感兴趣的DNA插入物。

虽然质粒中发现的一些元件是天然产生的，但其它一些元件可以是经过工 程改造提高该质粒作为DNA载体的有用性的元件。这些元件包括抗生素或化 学物质抗性基因以及多克隆位点(MCS)等。这些元件各自在本发明、以及现有 技术中起到某种作用。各元件所起作用的描述将突出说明现有技术的局限，并 证明本发明的有用性。

可由宿主获得的一类特别有用的质粒携带基因是能产生抗生素抗性的基 因。在平常的重组DNA技术实践中，抗生素抗性基因用作阳性或阴性选择元 件，以便与其它质粒相比，优先增强所述质粒的培养和扩增。

为了被宿主细菌保持，质粒一定也含有指导宿主复制该质粒的序列段。称 为复制起点(ORI)元件的序列能指导宿主利用其细胞酶产生质粒拷贝。这类细 菌分裂时，子细胞各自保持了这类质粒的一个或多个拷贝。使某些大肠杆菌(E. coli)菌株衍生化，以最大程度提高这种复制，使每个细菌产生高达300个拷贝。 以此方式，可提高所需质粒的培育。

在任何克隆载体中另一种必需元件是插入感兴趣遗传物质的位置。这是经 工程改造进入＂野生型＂质粒，从而使该质粒可用作克隆载体的合成元件。市售 克隆载体质粒一般含有至少一个这种区域，称为多克隆位点(MCS)。MCS一般 含有可被一种或一系列限制性核酸内切酶(下文称为＂限制性酶＂)切割的核苷酸 序列，各酶具有不同的核酸内切酶限制性位点和切割模式。DNA分子中编码 的这些核酸内切酶位点或核酸内切酶限制性位点(下文称为＂限制性位点＂)一般 含有双链回文序列。就一些限制性酶而言，少至4-6个核苷酸足以提供限制性 位点，而一些限制性酶需要8个或更多个核苷酸的限制性位点。例如，酶EcoR1 能识别六核苷酸序列：^5′G-A-A-T-T-C^3′，其中5′表示通常称作＂上游＂末端的分 子末端，类似地，3′表示＂下游＂末端。该限制性位点的互补链是其反相平行链 ^3′G-A-A-T-T-C-^5′。因此，双链限制性位点可存在于较大的双链分子中，其中它 表示为：

^5′G-A-A-T-T-C^3′

^3′C-T-T-A-A-G^5′