[发明专利]SiRNA在器官储存/再灌注溶液中的应用

说明书

发明领域

本发明涉及在储存、再灌注和运输过程中对器官、组织和细胞的 保存。更具体来说，本发明涉及使用储存/再灌注溶液对器官、组织和 细胞进行调节，该溶液能够最小化和/或防止器官、组织和细胞的损伤， 从而使器官、组织或细胞可以用于体内移植。总的来说，本发明也涉 及了将器官、组织和细胞维持在存活状态的方法。

发明背景

树突状细胞(DC)是免疫功能的关键控制物，因为它们既能诱导 免疫刺激又能诱导免疫抑制。决定DC将是刺激性的还是抑制性的关键 因素是可溶性的和膜结合的信号的表达。例如，CD80、CD86和IL-12 对DC的抑制赋予它们抑制免疫系统活化的能力。另一方面，对DC抑 制性信号例如PD-IL的抑制使得DC变成T细胞反应的更有力的激活 剂。已经通过抗体阻断(Goldberg等，Transpl Int，1994.7Suppl 1：p. S252-4)、反义寡聚核苷酸(Liang等，Transplant Proc，2001.33(1-2)： p.235)和化学免疫抑制剂(Lagaraine等，2003.75(9Supplm)：p. 37S-42S)进行了对这些DC衍生信号的操纵。不幸的是，所有这些方 法都具有明显的缺陷，限制了它们进入临床。

最近，已经开发了小干扰RNA(siRNA)，与其它已知的基因抑 制方法相比，它提供了更为有力、特异和持续时间长的基因抑制(Scherr 等，Curr Med Chem，2003.10(3)：p.245-56)。已经证实低浓度的siRNA 可以用于沉默DC细胞因子的生产，并调节DC活化T细胞的能力。本 申请人的PCT CA03/00867描述了通过使用siRNA对免疫细胞、包括 DC的操纵，以及使用siRNA沉默的DC修饰T细胞反应的方法。

组织和器官的移植需要提供活的组织和器官。自体和异体移植受 到组织或器官在移植之前该组织或器官可以维持存活的时间的限制。 供体器官在低温条件下(4℃)在特别配制的灌注溶液中进行冲洗和储 存，以便洗掉碎片并减小在运输过程中的损伤。这些溶液根据它们模 拟的生理环境可以被广义上区分为“细胞外的”和“细胞内的”。所 述溶液含有活性成分，所述活性成分在再灌注过程中能够最小化由低 温引起的细胞膨胀、抑制由缺血导致的酸中毒、最小化细胞外膨胀、 最小化自由基损伤并提供ATP再生的底物。美国专利No.5,110,722以 及美国专利申请序号2003/0109433和2005/0100876描述了用来得到更 好的移植功能的器官储存溶液。也可以通过加入自由基保护剂、胱天 蛋白酶(caspase)抑制剂和血管紧张肽转换酶抑制剂来调节器官储存 溶液(Baker等，J Surg Res，1999.86(1)：p.145-9；McAnulty等， Cryobiology，1996，33(2)：P.217-25；Natori等，Liver Transpl，2003.9(3)： p.278-84；Randsbaek等，Scand Cardiovasc J，2000192(1)：p.31-40)。

已经尝试了通过使用抑制供体辅助刺激分子并增加移植存活率的 灌注溶液来尝试免疫调制(Wekerle等，Curr Opin Immunol，2002.14(5)： p.592-600)。已经证实了使用裸反义DNA灌注肾脏移植物能够抑制 细胞内粘附分子-1的表达(Chen等，Transplantation，1999.68(6)：p. 880-7)。类似地，通过在器官储存溶液中添加诱骗寡核苷酸，在心脏 同种异体移植物中进行了NF-κB活性的抑制(Vos等，Faseb J，2000. 14(5)：p.592-600)。但是，这两种方法都需要高浓度的寡核苷酸用于 诱导，这导致了边缘性的疗效。

美国专利申请公布No.2006/0073127描述了使用选定的RNAi剂 来制备用于移植的组织。但是，该方法使用短灌注时间，并且组织的 储存被维持在通常4℃的冷藏温度下。此外，使用裸siRNA显示出导 致组织中扩散差，因此是无效的。Bradley等(Transplantation Proceedings， 37，233-236，2005)简单地证明了使用siRNA进行胰岛细胞的成像。

因此，非常希望能够提供改进的器官储存/再灌注溶液以及使用它 们的方法，从而有效调节器官、组织和细胞降低免疫识别，进而引起 存活率和受体接受程度的改进。

发明简述