[发明专利]制备永久人细胞系的方法

说明书

本发明涉及一种制备永久人细胞系的方法，其中用允许至少一种细胞 转化因子表达的序列和允许至少一种重组多肽表达的序列同时转染分离的 原代人细胞。

用于治疗、诊断或技术目的的重组多肽在细胞培养(体外)中的制备，通 常在稳定、持久或永久性建立的、其中编码所述多肽的核酸整合到细胞染 色体DNA中的细胞系(所谓生产细胞系)中实施。这些生产细胞系尤其必须 展现两种特征性质：首先，它们必须持久(永久性)地在细胞培养中生长并且 能够增殖，其次，它们必须表达编码期望多肽的基因，而该多肽随后能够 从细胞或者从培养上清液中分离。除了细菌之外，特别地，使用酵母和植 物细胞、动物细胞来制备重组多肽。当前全部治疗用蛋白质中大约60-70％ 是在哺乳动物细胞中制备的(Wurm，Nat.Biotechnology 22，1393-1398， 2004)。生产细胞的制备通常开始于已经被永生化或转化，在细胞培养中永 久生长和增殖的细胞系，例如来源于动物的CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、BHK (幼仓鼠肾)细胞、NS0(小鼠骨髓瘤)细胞或人HEK293(人胚胎肾)细胞或 PER.C6细胞。这些细胞系同时已经商品化，它们是从原代细胞通过培养生 成的，实质上是作为通过遗传操作的生产细胞建立方法的第一步；或者是 从自然肿瘤分离的。

在产生实际的生产细胞的情况下，一方面，通过转染将编码重组多肽 的核酸(所谓转基因)与必要的转录调控元件一同转移到这些已经建立的细 胞系中，另一方面，转移第二表达盒，该表达盒具有编码选择标记的基因， 其基因产物为细胞提供特定的选择优势。基因转移后在没有选择试剂的培 养基中培育细胞数天，然后给培养基提供合适的选择试剂。在选择试剂的 存在下，只有摄取了用于转染的核酸并表达选择标记的细胞方可生存和生 长。常用的选择标记有新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和二氢叶酸还原 酶(DHFR)(Wurm，Nat.Biotechnology 22：1393-1398，2004；Wurm and Jordan， 309-333 in：Makrides(Eds.)，Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells， Elsevier，Amsterdam，2003)。相应地分别在含有选择试剂，例如新霉素或潮 霉素等抗生素，和含有合成糖皮质素甲氨蝶呤的培养基中进行选择。对于 经过选择过程后存活并增殖的、具有选择标记和转基因的细胞(即所谓转化 体)，一般随后加以个体化(individualised)(克隆)以保证培养物中所有的细胞 是遗传上同一的，并将具有最佳产率的期望生产细胞系与生产力较差的细 胞系分开。

取决于制备过程，可能不但在选择期中，而且在后来克隆细胞的生长 过程中均必须向培养基中加入选择试剂，以保证生产细胞系的遗传稳定性。 期望多肽的基因(转基因)和选择标记的基因通常整合到细胞基因组的相同 位点中。如果在随后的细胞扩增中或制备期中没有选择压力，则会发生细 胞丧失选择标记-也随之丧失期望多肽的转基因-的危险。通过持续添加 选择试剂来防止这种危险。

从生物体或组织取出后投入细胞培养的原代动物和人细胞通常只能短 期生长并经过少数几次传代。人细胞特别适于制备人生物治疗剂，因为与 其它生物哺乳动物或动物细胞相反，它们可表达具有真实的翻译后修饰模 式的复杂多肽。与在非人生产系统中生产相比，在使用人细胞生产的情况 下，复杂的重组蛋白的糖基化模式(即分子内糖残基的结构和构象)会更好地 重现真实人多肽的模式。该糖基化模式在很多时候对于多肽的重要性质例 如生物学活性、稳定性、溶解性和免疫原性而言具有决定性的重要性。