[发明专利]用于生产具有增强的效应子功能的抗体恒定区的宿主细胞系

说明书

发明领域

本发明涉及可用于重组DNA技术并用于在细胞培养物中生产蛋 白的细胞、细胞系和细胞培养物。更具体地说，本发明涉及能够在化 学成分确定的培养基中生长、提供增强的抗体效应子功能的克隆骨髓 瘤细胞系。

发明背景

抗体经常被称为与体液免疫机制和细胞免疫机制有关的衔接分 子：体液应答主要归因于能够高亲和性结合靶抗原的成熟的分泌性循 环抗体，所述高亲和性由可变区的固有特异性赋予。细胞应答归因于 通过抗体-抗原(ab-ag)复合物的结合和由于ab-ag复合物结合效应细胞 导致的细胞介质释放引起的下游后发事件导致的细胞活化的结果。这 些细胞应答包括中和靶、调理和敏化(如果抗原展示在细胞表面)，肥 大细胞敏化以及补体活化。对于作为细胞表面抗原的细胞靶，这些效 应子功能导致通常所谓的抗体导向的细胞毒性(ADCC)和补体介导的 细胞毒性(CDC)。

正是所谓的抗体的可变区和高变区负责特异性抗原识别，是所谓 的异二聚体重链部分的恒定区Fc部分与存在于多种通常高活动性细 胞上的这些Fc受体相互作用，能够刺激这些细胞，以影响某些功能， 包括抗体摄入和细胞毒性机制或ADCC、CDC，并还影响抗体与多种 受体的结合，包括与C1q蛋白的结合。这些受体被称为Fc受体。

在抗体同种型(例如IgA、IgE、IgD、IgG和IgM)中，IgG是最丰 富的，IgG1亚类表现出最显著程度和系列的效应子功能。IgG1型抗 体是癌症免疫治疗中最常用的抗体。在结构上，IgG铰链区和CH2结 构域在抗体效应子功能中起主要作用。存在于Fc区(由铰链、CH2和 CH3结构域的二聚体形成)中的N-联寡糖影响效应子功能(图1)。所有 天然抗体的Fc部分都在重链中的保守位置进一步被糖链修饰。在IgG 同种型中，N-联糖基化位点位于Asn297，其处于每个CH2结构域中。 因为恒定区随同种型变化，所以每种同种型都具有一系列不同的N- 联糖结构，该结构可变地影响蛋白组装、分泌或功能活性(Wright，A. 和Morrison，S.L.，Trends Biotech.15：26-32(1997))。所连接的N-联糖 的结构变化相当大，取决于加工程度，并可包含高甘露糖、多分支以 及双触角的复合寡糖和唾液酸(N-乙酰基神经氨酸或NANA)、岩藻糖、 半乳糖和GlcNAc(N-乙酰基葡糖胺)残基作为末端糖，如图2所示。 业已知晓宿主细胞和抗体的寡糖含量对效应子功能的影响(Lifely，M. R.等，1995 Glycobiology 5：813-822；Jefferis，R.等，1998 Immunol Rev. 163：59-76；Wright，A.和Morrison，S.L.，出处同上；Presta L.2003.Curr Opin Struct Biol.13(4)：519-25)。而且，关于抗体中的糖链，已报道在 抗体的N-糖苷-联糖链中的还原性末端的近端N-乙酰基葡糖胺处加入 或修饰岩藻糖，显著改变抗体的ADCC活性(WO00/61739)。

另外，使用稳定工程化的宿主细胞进行重组治疗性蛋白生产在传 统上要求使用补加化学成分不确定的动物源组分(例如血清或器官提 取物)的培养基。除批间差异性问题之外，在使用这些组分时，将产品 与这些杂质纯化开来的需要以及传播人病原体的可能性提升。由于牛 海绵状脑病(BSE)的发现，这种敏感性在近些年已变得更严重，牛海 绵状脑病是一种牛神经退化性疾病，也称为疯牛病，与一般被认为是 侵袭人类的疾病的病原体的克雅氏病(vCJD)无法区分(Bruce等， Nature 389：498-501，1997)。因此，许多管理机构强烈推荐在细胞培养 基中不连续地或有限地使用动物源物质。因此，现在可得到用于哺乳 动物细胞生长和维持的化学成分确定的(“CD”)培养基，其是无血清 的(SF)和/或无动物源蛋白的(APF)。CD培养基的缺点在于，大部分生 产细胞系不适应在其中生长或生长缓慢和生产差。因此，用于生产糖 基化优化的治疗蛋白的理想生产细胞系在CD培养基中生长的同时还 能够以大规模的工业化能力生产重组蛋白。