[发明专利]通过同步化植物细胞培养的次级代谢产物批量生产的稳定化方法

说明书

技术领域

植物在我们生活中的应用越来越重要了，它不仅是我们食物的供应者，而且还是许多化学物质的来源，如药物、香精、颜料、农业化学药品和染料等都来源于植物。由植物生产的生物活性物质大部分是次级代谢产物。因为绝大多数次级代谢产物用作生理活性物质，所以人们对这些次级代谢产物具有很大的兴趣，诸如生物碱、过敏原、氨基酸、蒽醌、白血病抑制剂、杀菌剂、肿瘤抑制剂、抗病毒试剂、酶、类黄酮、杀虫剂、鸦片剂、香料、色素、维生素和多糖等。根据Zhong(2002)报道，大约存在100,000种次级代谢产物已被人们所知；在实践使用的药物中有25％以上来源于植物。每年都有新发现的次级代谢产物产生。

在获得这些代谢产物的方法中仍然存在许多问题，诸如，虽然近年来有机化学飞速发展但是仍难于化学合成这些代谢产物，因过度开采和污染环境造成对自然界的破坏和因季节、地区和气候等生产条件的变化代谢产物的成分发生改变并造成生产成本增加。因此，通过体外培养技术生产次级代谢产物的方法正处在积极研制阶段，这种体外培养技术即使在很小的空间内也可以适当控制外部环境条件进行大规模生产。

背景技术

根据韩国专利0130100，通过植物细胞培养生产生物活性物质比直接从植物中提取这些物质有更多的优点。植物细胞培养不仅不受环境影响而且可以解决生态破坏的问题，所以这种方法被认为是能够进行连续生产的最佳方法。

但是，Nail和Roberts(2004)指出用植物细胞培养生产次级代谢产物生长速率慢且产率较低。为了解决这一问题，Zhong(2002)进行了优化培养基、培养条件、工艺和诱导条件等从而提高产率的研究)。在国际专利WO93/17121中，各种培养基被用于培养多种紫杉以便增加细胞生长速率和紫杉醇(paclitaxel)产率。实验的结果指出了生产大量紫杉醇的诱导条件。尽管这种方法提高了有价值的次级代谢产物的生产，然而对于从紫杉中生产紫杉醇或从许多植物中生产有价值的代谢物质来说可变性仍然是主要问题。

只有当在长期培养过程中稳定地保持细胞快速生长和代谢产物的高产量时，通过大规模的植物细胞培养来生产次级代谢产物才有商业化的可能。可产生独特代谢产物的细胞系的性能不稳定，这种不稳定在继代培养中导致细胞系丧失它们最初的产率；还不能太多的说成功和失败取决于我们如何克服这些问题。

在植物细胞培养中，尽管细胞来源于一种植物，但每个细胞系代谢产物的产率不同且不稳定。因此，建立具有高产率和遗传稳定性的细胞系比任何其它事情都重要。

来自单细胞和多细胞的细胞系

来自单细胞植物细胞系比来自多细胞的植物细胞系具有较低的可变性；这导致细胞系的产率来自单细胞高于来自多细胞的。在在先发明中，茎、根、种子、针叶和叶子被用作最好的外植体来诱导细胞系的产生。这些茎、根、种子、针叶和叶子是由不同功能和形态的细胞构成的组织。来自这些组织中的愈伤组织细胞系不止一种。因此，在试图降低来自由多细胞构成的组织的愈伤组织的变种产率方面存在一些限制。

细胞凝集

植物细胞培养的一个明显特征是细胞凝集。根据专利0364478记载，植物细胞的直径为30-300μm，大约比动物细胞大30倍。由于植物细胞具有粘附在一起的天然趋势，所以不可能得到仅仅由分散的单个细胞构成的悬浮液。细胞凝集的比例和尺寸随植物种类和培养物生长的培养基变化而变化。Nail和Roberts指出，细胞凝集导致细胞内外局部环境的不同，这导致了培养物的异质性并最终可导致生长和代谢的变化。

悬浮培养的目的是得到纯的单个细胞。为了实现该目标，可以使用过滤、离析和通过酶的原生质培养方法。但是，过滤和离析并不能获得完全纯化的单个细胞。去除细胞壁的原生质培养技术是产生单细胞的最可靠方法，但是用于培养原生质的酶可引起细胞壁损伤或破损，最终导致细胞生理系统的变化。此外，疏水的次级代谢产物诸如紫杉醇可储存在细胞壁中，使细胞壁的变化与产率之间具有意义深远的关系。

而且，细胞凝集已经是对细胞生长的计数精确测定和对独立细胞的生物化学分析的主要障碍。根据Nail和Roberts(2004)报道，如果单个细胞培养成为可能，将会容易地获得关于培养中细胞单位活动的更快的信息，诸如次级代谢产物中的生物合成、储存和降解等信息。

去分化