[发明专利]抗蛋白酶解的抗体制剂

说明书

发明领域

本发明涉及评估抗体的糖形含量，更具体的说涉及制备和使用基 本上均一的糖形(homogeneous glycoform)，例如非唾液酸化糖形的抗 体制剂的方法。

技术背景

抗体是可溶性血清糖蛋白，在先天免疫中起到重要的作用。所有 天然产生的抗体其重链恒定区中的保守位置处的糖结构随同种型的 不同而不同(图1)。每种同种型各有独特的一套N-连接寡糖结构，该 结构对蛋白质装配、分泌或功能活性有不同影响(Wright，A.和 Morrison，S.L.，Trends Biotech.15：26-32(1997))。附接的N-连接寡糖的 结构(图2)因加工程度的不同相差甚大，可包括高甘露糖以及具有或不 具有等分GlcNAc和核心岩藻糖残基的复杂二天线型寡糖(Wright，A. 和Morrison，S.L.同上)。通常，附接在特定糖基化位点的核心寡糖结 构会发生不均一加工，使得甚至单克隆抗体也以多种糖形存在。同样， 已证实各种产抗体细胞系之间在抗体糖基化方面差别显著，而在不同 培养条件下生长的特定细胞系中观察到的差别不显著。

在各种抗体同种型(例如IgE、IgD、IgA、IgM和IgG)中，IgG最 为丰富，其中IgG1亚类显示最显著程度和类别的效应子功能。IgG1 类型的抗体在通常认为其中ADCC和CDC活性重要的癌症免疫疗法 中是最常用的抗体。在结构上，IgG铰链区和CH2结构域在抗体效应 子功能中起到主要作用。Fc区中存在的N-连接寡糖(通过铰链、CH2 和CH3结构域的二聚化形成)会影响效应子功能。这些共价结合的寡 糖是复杂的二天线型结构，且高度不均一(heterogeneous)(参见图2)； NANA、5-N-乙酰神经氨酸(NeuAc)或NGNA、5-N-羟乙酰神经氨酸 (NeuGc)是通常的“唾液酸”。其它唾液酸已被发现或可化学合成。每个 CH2结构域中Asn297处为保守N-连接糖基化位点。在成熟抗体中， 附接到Asn297的两个复杂二天线型寡糖隐藏在CH2结构域之间，与 多肽骨架形成广泛的接触。已发现它们的存在对于抗体介导效应子功 能如ADCC是必要的(Lifely，M.R.等，Glycobiology 5：813-822(1995)； Jefferis，R.等，Immunol Rev.163：59-76(1998)；Wright，A.和Morrison，S. L.同上)。

已开始研究特定位置处的各个糖类的生物学存在和意义。例如， 抗体糖基化的程度受年龄、性别和疾病的影响(Raju，T.S.等， Glycobiology 2000.10(5)：477-86)。一般来说，寡糖结构有一定的物种 特异性，因此相差甚大。此外，还研究了具有和不具有等分GlcNAc 和核心岩藻糖残基的寡糖结构的生物学意义。人IgG和许多重组产生 的IgG含有少量的唾液酸化(或者未唾液酸化(unsialylated)或无唾液酸 化(asialyated))寡糖，但是，大多数IgG含有非唾液酸化(non-sialylated) 寡糖结构。

抗体的蛋白酶解切割通常在生理条件下发生，这也可以是基于抗 体结构的生物治疗药物的生产中的一个工业加工步骤。木瓜蛋白酶产 生或加工的治疗性抗体片段Fab正得到更为广泛的使用。尽管木瓜蛋 白酶是植物来源的酶，但在IgG1铰链中鉴定出多个蛋白酶切割位点， 总结于图3。