[发明专利]用于琥珀酸盐之生长关联性生产的方法和生物

说明书

发明背景

此发明总的来说与生物的电脑模拟设计有关，更具体地说，与具 有选定基因型(此基因型适用于琥珀酸盐之生长关联性生产)的生物 有关。

琥珀酸盐是一种具有巨大商业价值的化合物，可在食品、制药、 洗涤剂和聚合物等行业用作商用化学品的前体。由发酵产生的琥珀酸 盐每年可提供超过2.7x10⁸千克的工业产品，包括1，4丁二醇和相 关产品、四氢呋喃、γ-丁内酯、n-甲基吡咯烷酮(NMP)和2-吡咯烷 酮，Zeikus et al.，Appl Microbiol Biotechnol，51：545-552(1999)。 琥珀酸的基本化学性质与石化产物马来酸/酸酐类似，因此生产成本是 阻碍其大量进入广阔市场的唯一因素。琥珀酸盐的生物性生产也是一 个绿色工艺，因为在糖发酵过程中必须将温室气体二氧化碳(CO2)固 定到琥珀酸盐中。因此，1，4-二酸(琥珀酸盐、延胡索酸盐和苹果酸 盐)属于美国能源部从300多种接受评估的候选产品中选择出的优先 进行生物工艺开发的十二种化合物之列。

像琥珀酸盐这样的中央代谢化合物为代谢工程提供了良好的初步 目标，因为他们常常在基础代谢中快速合成。能够使用碳水化合物天 然生产琥珀酸盐的生物有：Anaerobiospirillum succiniciproducens，Samuelov et al.，Appl Environ Microbiol， 65：2260-63(1999)，Lee et al.，Appl Microbiol Biotechnol， 54：23-27(2000)，Lee et al.，Biotechnol Lett，25：111-14(2003)； Actinobacillus succinogenes，Guettler et al.，Int J Syst Bacteriol，49：207-16(1999)，Urbance et al.，Appl Microbiol Biotechnol，65：664-70(2004)，以及最近完成基因排序的牛瘤胃细 菌Mannheimia succiniciproducens，Lee et al.，Bioprocess Biosyst Eng，26：63-7(2003)，Hong et al.，Nat Biotechnol， 22：1275-81(2004)，Lee et al.，Appl Microbiol Biotechnol， 58：663-8(2002)。另外，有些报道宣称已通过各种代谢工程策略构 建了琥珀酸盐产量大幅提高的大肠杆菌(Escherichia coli)株系。 这些研究均关注于流向琥珀酸盐之碳通道的增加和辅酶NADH的可用 性。例如，PEP羧化酶(ppc)的过表达，Millard et al.，Appl Environ Microbiol，62：1808-10(1996)，和Rhizobium etli丙酮酸羧化酶 (pyc)的表达，Gokarn et al.，Biotechnol Lett，20：795-798(1998)， 已可通过提高进入TCA循环之琥珀酸盐支路的碳通量而在E.coli中 相应获得0.30g/g和0.17g/g的琥珀酸盐产量。另外，缺乏乳酸 脱氢酶(ldh)和丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)(即NZN111株系)的E.coli 变异株系以及E.coli过表达，Stols et al.，Appl Environ Microbiol， 63：2695-701(1997)，Hong et al.，Biotechnol Bioeng，74：89-95 (2001)或Ascaris suum，Stols et al.，Appl Biochem Biotechnol， 63-65：153-8(1997)和苹果酶，已可提高琥珀酸盐产量。NZN111中 另外一个自发染色体突变，随后映射到磷酸转移酶系统的ptsG基因， Chatterjee et al.，Appl Environ Microbiol，67：148-54(2001)， 产生了厌氧琥珀酸盐产量为1mol/mol葡萄糖(0.66g/g)的AFP111 株系，Donnelly et al.，Appl Biochem Biotechnol，70-72：187-98 (1998)。NZN111和AFP111株系在R.etli丙酮酸羧化酶存在和不 存在情况下的各种属性也在厌氧和双阶段(即先有氧生长再厌氧生产) 条件下进行了研究，Vemuri et al.，Appl Environ Microbiol， 68：1715-27，18(2002)。Vemuri et al.，J IndMicrobiol Biotechnol， 28：325-32(2002)，产量约0.96g/g。其他研究获得了生产琥珀酸盐 的E.coli株系，能够有氧生产0.91mol/mol(0.60g/g)，Lin et al.，Metab Eng，(2005)，(已接受发表)，以及厌氧生产1.6mol/mol (1.0g/g)，Sanchez et al.，Metab Eng，7：229-39(2005)。