[发明专利]细胞核移植

说明书

发明领域

本发明涉及在哺乳动物中细胞核移植的方法，并涉及获得的遗传 修饰的哺乳动物或可通过该方法获得的遗传修饰的动物。而且，本发 明涉及卵母细胞、受精卵、胚胎(其中包括胚泡)的玻璃化方法。

发明背景

对供体细胞进行遗传修饰并将其用于核移植的能力提供了生产遗 传修饰的动物的工具，所述遗传修饰的动物可用于例如严重人类疾病 研究和药物测试中的疾病模型。

传统的细胞核移植技术包括2步显微操作。第一步包括成熟卵母 细胞的去核，第二步包括供体细胞核的转移。然而，已证明显微操作 具有几处缺点，例如需要昂贵的设备，需要高水平技术人员以及耗时 的工作。

最近开发出使用体细胞作为供体细胞的改进的核移植方法——一 种被称为手工克隆(HMC)的方法，其包括使用无透明带的卵母细胞。 该方法与传统的核移植相比，简化之处在于不再需要显微操作。该方 法已经用在牛中(Vajta等2001 Cloning 3，89-95；Vajta等2003 Biol.Reprod.68，571-578；Vajta等2005 Reprod.Fertil.Dev.17， 1-16；Tecirlioglu等，2004)。而且，已有记录在牛(Booth等2001 Cloning Stem Cells 3，139-150；Oback等Cloning Stem Cells 5， 3-12)和猪(Booth等2001 Cloning Stem Cells 3，191-197)中使用 一步显微操作的无透明带核移植的应用。该方法技术要求更低、时间 消耗更少的事实已促使研究者建议将HMC技术用于其他物种。然而， 大量的技术问题使得HMC在猪中的应用比初步设想的要求更高。所面 临的问题之一涉及猪卵母细胞的低浮力密度，这包括透明带完整(ZI) 以及尤其是无透明带(ZF)的猪卵母细胞。因此，猪卵母细胞不沉降 到平皿的底部。此外，这些卵母细胞的表面具有粘性，当去除透明带 后很难避免它们之间的附着。而且，ZF猪卵母细胞非常易碎，很难以 对待牛卵母细胞中描述的方式将其二分。

最近，HMC技术被应用在猪核移植中，但效率低，其中使用遗传修 饰的体细胞-成纤维细胞作为供体细胞从而产生遗传修饰的克隆胚泡 (Kragh等2004 Reproduction，Fertility and Development 16， 315-318)。

本发明改进了通过HMC进行体细胞核移植的技术，从而产生了提 高的胚胎重建率，并因此使获得遗传修饰动物的机会显著升高。

通过核移植方法大规模产生遗传修饰动物的障碍之一是无法通过 应用在其他物种上的方法深低温保藏猪卵母细胞和胚胎。这是因为猪 卵母细胞和胚胎的高脂质含量。克隆猪胚胎的深低温保藏可通过缓解 后勤问题而显著改善体细胞克隆的产量。然而，最近发表了一种非侵 入性方案，其通过离心但不需要随后的显微操作(Esaki等2004 Biol Reprod.71，432-6)而对猪胚胎去脂。

发明概述

本发明一方面涉及细胞核移植的方法，其包括以下步骤：a)构建 具有至少一部分经修饰的透明带的至少一个卵母细胞，b)将该卵母细 胞分成至少2部分，从而获得至少一个细胞质体，c)构建具有所需遗 传特性的供体细胞或细胞核，d)将至少一个细胞质体与该供体细胞或 膜包围的细胞核融合，e)得到重建的胚胎。

本发明第二方面涉及细胞核移植方法，其包括以下步骤：a)构建 至少一个卵母细胞，b)将该卵母细胞分成至少3部分，从而获得至少 2个细胞质体，c)构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核，d) 将至少一个细胞质体与该供体细胞或膜包围的细胞核融合，e)得到重 建的胚胎。

本发明第三方面涉及产生遗传修饰的或转基因的非人类哺乳动物 的方法，其包括以下步骤：a)构建具有至少一部分经修饰的透明带的 至少一个卵母细胞，b)将该卵母细胞分成至少2部分，从而获得具有 核的卵母细胞和至少一个细胞质体，c)构建具有所需遗传特性的供体 细胞或细胞核，d)将至少一个细胞质体与该供体细胞或膜包围的细胞 核融合，e)得到重建的胚胎，f)活化该重建的胚胎以形成胚胎，g) 培养所述胚胎，以及h)将所述的培养胚胎转移到寄主哺乳动物中， 使得该胚胎发育成遗传修饰的胎儿。