[发明专利]分离核酸的方法

说明书

相关申请案

本申请案为2005年9月20日申请的美国申请案第11/231,363号的接续申请案，其为2003年4月2日申请的美国申请案第10/406,141号的部分接续申请案且为国际申请案第PCT/US2004/009960号(其指定美国，申请于2004年4月1日，且以英文公开)的部分接续申请案。上述申请案的全部教示是以引用的方式并入本文中。

背景技术

考量哺乳动物细胞的转染、转导或微注射的许多分子生物学应用(诸如毛细管电泳、核苷酸测序、逆转录克隆和基因治疗方案)需要分离高质量核酸制剂。

高要求分子生物学应用的出现已增加对于能够产生高质量核酸制剂的高产量且优选易于自动化的纯化方案的需求。尽管近来技术进步和机器人技术的出现已促进测序反应和凝胶读取步骤的自动化，但产量仍受到易于自动化的核酸纯化方法的可用性的限制。

发明内容

如本文中所述，本申请人提供一种方法，其中细胞或有机体的基因组核酸可直接从细胞或有机体生长培养物与细胞或有机体中分子量低于基因组核酸分子量的核酸(例如质粒DNA)分离。另外，本申请人提供一种方法，其中在细胞或有机体溶解产物中基因组核酸可与分子量低于基因组核酸分子量的核酸分离，而无需制备澄清溶解产物(lysate)。

传统碱性溶解(lysis)需要以下步骤：浓缩或粒化(pelleting)稀释于生长培养基中的细胞；离心或涡旋；用碱性去垢剂溶解细胞；振荡和/或搅拌溶解产物；添加中和缓冲液；过滤和/或处理样品以移除絮状物；添加固相载体；且添加结合缓冲液。通常需要如下其它纯化步骤以移除去垢剂和盐：添加固相载体且添加结合缓冲液。

本发明的优点在于其允许将细胞或有机体的基因组核酸与细胞或有机体中分子量低于基因组核酸分子量的核酸分离的简化程序。通过提供固相载体和使得细胞或有机体溶解且细胞或有机体的核酸沉淀于所述固相载体上的试剂(核酸沉淀剂)，可从纯化来自完整或全细胞或有机体的核酸的标准纯化方法中去除一或多个步骤。此外，通过提供固相载体和使得细胞或有机体的核酸沉淀于所述固相载体上的试剂，可从纯化来自细胞或有机体溶解产物的核酸的标准纯化方法中去除一或多个步骤。固相载体和试剂与细胞、有机体、细胞溶解产物或有机体溶解产物合并的次序并不关键。固相载体和使得细胞或有机体的核酸沉淀于所述固相载体上和/或细胞或有机体溶解的试剂可依次(例如，以单独组分形式；在两个步骤中)或同时(例如，以单一组分形式；在一个步骤中)与细胞、有机体、细胞溶解产物或有机体溶解产物合并。当固相载体和试剂合并为单一组分时，本文中所述的方法允许将单一试剂添加到细胞或有机体、或细胞或有机体的培养物中，接着培养，分离(一或多种)固相载体且选择性洗脱以实现细胞或有机体的基因组核酸与细胞或有机体的分子量低于基因组核酸分子量的核酸的分离。本发明的方法不需要pH值调节。由本文中所述的试剂和方法提供的减少的步骤数会简化细胞、有机体、细胞溶解产物或有机体溶解产物的核酸纯化方法的自动操作。

因此，本发明涉及一种将细胞或有机体的基因组核酸与细胞或有机体中分子量低于基因组核酸分子量的核酸(例如质粒DNA、游离基因DNA、线粒体DNA、细胞器DNA、病毒DNA)分离的方法，其包含合并i)固相载体(例如磁性微粒)，其表面上已结合可逆结合核酸的官能团(例如羧基、胺基)，ii)细胞或有机体和iii)试剂，其中所述试剂使得细胞或有机体溶解且细胞或有机体的核酸沉淀于固相载体上，从而产生组合。将所述组合保持在细胞或有机体发生溶解且细胞或有机体的核酸与固相载体可逆结合的条件下，从而产生具有与固相载体结合的细胞或有机体的核酸的固相载体。将固相载体与组合分离且与使得分子量低于基因组核酸的核酸从固相载体洗脱(选择性洗脱)的洗脱缓冲液(例如水)接触。基因组核酸保持与固相载体结合，从而使得细胞或有机体的基因组核酸与细胞或有机体中分子量低于基因组核酸分子量的核酸分离。