[发明专利]使用低温下结晶纯化APO－2配体/TRAIL的方法

权利要求书

1.一种从混合物回收Apo2L/TRAIL的方法，包括

(a)将混合物加载到阳离子交换柱上；

(b)用平衡缓冲液冲洗阳离子交换柱，从而去除混合物中存在的非结合性组分；

(c)用洗脱缓冲液洗脱结合在阳离子交换柱上的Apo2L/TRAIL；

(d)将洗脱物逐渐冷却到大约2～4℃的温度，从而使Apo2L/TRAIL以晶体形式自发沉淀，产生母液和Apo2L/TRAIL晶体的混合物，和

(e)从步骤(d)中所得混合物中回收纯度为至少大约99％的Apo2L/TRAIL。

2.权利要求1的方法，其中加载到阳离子交换柱上的混合物是产生Apo2L/TRAIL细胞的培养基或细胞溶解物。

3.权利要求2的方法，其中所述混合物是产生Apo2L/TRAIL的大肠杆菌宿主细胞的细胞溶解物。

4.权利要求3的方法，其中在加载到阳离子交换柱上之前将所述溶解物澄清。

5.权利要求1的方法，其中对步骤(c)所得的洗脱物不作进一步纯化而进行结晶步骤(d)。

6.权利要求1的方法，其中阳离子交换柱是SP-Sepharose柱。

7.权利要求6的方法，其中加载到阳离子交换柱上的混合物的pH是大约7.5或者被调整为大约7.5。

8.权利要求6的方法，其中Apo2L/TRAIL的洗脱在如下所述的洗脱缓冲液中进行：该洗脱缓冲液在调整pH到7.5-7.8的缓冲剂中含有100-200mM NaCl或100-150mM Na₂SO₄。

9.权利要求1的方法，其中在步骤(d)中将洗脱物从约15℃到30℃的温度经过大约1到60个小时冷却到约2℃到8℃的温度。

10.权利要求9的方法，其中在步骤(d)中将洗脱物经过大约1到8个小时冷却到约2℃到8℃的温度。

11.权利要求9的方法，其中在步骤(d)中将洗脱物经过大约1个小时冷却到约2℃到8℃的温度。

12.权利要求11的方法，其中在步骤(d)中将洗脱物经过大约1个小时冷却到约4℃的温度。

13.权利要求1的方法，其中在结晶之前所述洗脱物的pH是pH 7.0-8.0或者被调整为pH 7.0-8.0。

14.权利要求13的方法，其中在结晶之前所述洗脱物的pH是大约7.3或者被调整为大约7.3。

15.权利要求13的方法，其中在结晶之前所述洗脱物的pH是大约pH7.5-8.0或者被调整为大约pH 7.5-8.0。

16.权利要求1的方法，其中在步骤(d)中维持约2℃到4℃的温度直至达到或近似达到Apo2L/TRAIL的平衡溶解度。

17.权利要求16的方法，其中在步骤(d)中添加抗溶剂来降低Apo2L/TRAIL的溶解度。

18.权利要求17的方法，其中所述抗溶剂选自下组中的一种或多种：聚乙二醇(PEG)、MPD、乙醇、异丙醇和二氧杂环己烷。

19.权利要求18的方法，其中所述PEG的分子量为大约400到大约10,000道尔顿之间。

20.权利要求19的方法，其中所述PEG的分子量为400、3,350或10,000道尔顿。

21.权利要求1的方法，其中在步骤(e)中以晶体的形式回收Apo2L/TRAIL，其中晶体是通过过滤、或离心、或其组合从所述母液分离的。

22.权利要求21的方法，其中在过滤之前将母液的pH调整到大约8.0以降低溶解度。

23.权利要求1的方法，还包括下述步骤：将上述方法步骤(d)中所获的Apo2L/TRAIL晶体溶解，并对所得溶液进行第二色谱纯化步骤。

24.权利要求23的方法，其中第二色谱纯化步骤是疏水相互作用色谱。

25.权利要求24的方法，其中疏水相互作用色谱在Phenyl-Sepharose柱上进行。