[发明专利]使用融合多肽的共翻译转运的噬菌体展示

说明书

发明领域

本发明涉及一种新噬菌体展示方法、本文使用的噬菌体或噬菌粒载体以及如此获得的噬菌体颗粒。

发明背景

多肽在噬菌体上的展示(噬菌体展示)是一种允许由一大群变体提取具有期望特性的多肽的选择技术(Russel，M.Lowman，H.B.和Clackson，T.Introduction to phage biology and phage display，载于“Phage Display”，Clackson，T.和Lowman，H.B.编辑，Oxford UniversityPress，2004，1-26页)。已广泛研究了用于由组合抗体或肽文库选择的噬菌体展示。

迄今为止，用于噬菌体展示的最广泛使用的噬菌体是丝状噬菌体。丝状噬菌体构成了一个感染许多革兰氏阴性细菌的大细菌病毒家族。最有名的丝状噬菌体是感染大肠杆菌的丝状噬菌体；这些丝状噬菌体是f1/M13/fd和Ike。噬菌体f1、M13和fd是迄今已用于丝状噬菌体展示的丝状噬菌体。它们的基因组超过98％相同，它们的基因产物可互换。

与许多其它噬菌体的组装相比，丝状噬菌体组装的独特方面在于其是一个分泌过程。壳体多肽向生长的噬菌体中的掺入发生在胞质膜中，新生噬菌体在它们组装时由细胞中被排出来(Russel等，在上述引文中)。大肠杆菌细胞在此过程中不裂解。5种病毒壳体蛋白(pIII、pVI、pVII、pVIII和pIX)在其掺入到噬菌体颗粒之前被插入到胞质膜中(图1)。例如，pIII的大部分被转运穿过膜进入周质，而其C-末端疏水尾将该蛋白锚定在膜中。

丝状噬菌体展示的一个先决条件是转运目标多肽(POI)穿过胞质膜。这一般通过将POI基因融合至噬菌体壳体蛋白并转运对应的融合多肽实现。或者，独立地转运POI和噬菌体壳体蛋白。在此情况下，POI通过例如形成二硫键(Cys-展示)或与对应的噬菌体壳体蛋白形成亮氨酸拉链(pJuFo系统)稳定连接至周质中的噬菌体颗粒。在使用与pIII融合的常规丝状噬菌体展示中，Sec途径用于转运含POI的融合多肽。在该途径中，多肽首先在核糖体处合成，然后以其未折叠态通过Sec转运翻译后转运(图2，(3)-(4)-(5))。也就是说，转运穿过胞质膜只有在已合成显著量的多肽链后才开始。但是，仍未完全阐明转运机制对成功的噬菌体展示的影响，现有技术没有研究使用共翻译转运途径的可能性。

业已将各种各样大小和结构的胞内和胞外蛋白功能性地展示在丝状噬菌体上(Russel等，在上述引文中)。然而，某些多肽由于个体特性而抗拒展示，大部分是由于未知的原因。这使得某些蛋白的成功展示变得不可预知。因此，通常推荐首先检验每种要使用蛋白在丝状噬菌体上的展示效率。另外，在建立用于噬菌体展示的组合文库时，不是所有克隆都以相似效率展示；对由cDNA产生的文库来说尤其如此。多肽的展示问题可能是其对噬菌体生产的干扰、其周质聚集、其蛋白分解、其对大肠杆菌的毒性或其与所用转运途径的不相容性的结果。转运前的步骤尤其是影响融合多肽掺入噬菌体颗粒中的一个重要因素。如果多肽过早折叠，则它们可能难以转运乃至表现出胞质毒性。因此，重要之处在于蛋白是翻译后(潜在地允许过早折叠)转运还是共翻译(不允许胞质折叠)转运。当前的丝状噬菌体展示方法使用翻译后途径转运融合多肽穿过胞质膜(Russel等，在上述引文中；Paschke，M.和W.Gene 350，79-88，2005)。因此，与这些途径不相容的多肽将难以展示，使噬菌体展示选择非常低效乃至不可能。例如，几乎专用于噬菌体展示的翻译后Sec途径固有地不能转运不能以未折叠态保持在胞质中的蛋白，因为Sec转运自身只能转运未折叠多肽(Huber，D.Boyd，D.Xia，Y.Olma，M.H.Gerstein，M.和Beckwith，J.J.Bacteriol.187，2983-2991，2005；Paschke等，在上述引文中)。

因此，构成本发明基础的技术问题是鉴别新转运方法，其通过使用翻译后转运将展示效率低的多肽有效展示在丝状噬菌体上。该技术问题的解决通过提供以权利要求为特征的实施方案来实现。

发明概述

本发明涉及一种丝状噬菌体展示方法，其中展示在噬菌体颗粒上的目标多肽(POI)被共翻译转运穿过革兰氏阴性细菌的胞质膜，具体地说是基于信号识别颗粒途径。

因此，本发明允许通过共翻译转运含POI的融合多肽进行噬菌体展示。该方法特别适用于已知难以展示在噬菌体上的多肽，以及cDNA文库和其它组合文库的蛋白，尤其是这些蛋白来源于非常快速折叠、稳定的蛋白支架时。