[发明专利]产生L－苏氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于发酵工业中的技术。更具体而言，本发明涉及通过使用埃希氏菌属(Escherichia)细菌的发酵有效产生L-苏氨酸的方法。L-苏氨酸是必需氨基酸之一，并且作为用于医学目的的营养混合物中的成分是有用的。还将其以多种方式使用作为动物饲料添加剂，和作为制药工业和化学工业中的反应剂。

背景技术

L-氨基酸例如L-苏氨酸和L-异亮氨酸是通过使用产生氨基酸的细菌的发酵以工业方法产生的，所述细菌例如具有产生这些L-氨基酸的能力的棒状杆菌型细菌(coryneform bacteria)或埃希氏菌属细菌。作为这些产生氨基酸的细菌，使用从自然界分离的细菌菌株或这些细菌菌株的人工突变体。使用细菌菌株的重组体以改进生产力(productivity)，所述重组体中通过基因重组等增强了L-氨基酸生物合成酶。

具体而言，产生L-苏氨酸的埃希氏菌属细菌的突变菌株是已知的，例如6-二甲基氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine)抗性菌株(Japanese Patent Laid-open(Kokai)No.5-304969)和疏螺旋体素(borrelidin)抗性菌株(国际专利公开WO98/04715)。使用重组埃希氏菌属细菌产生L-苏氨酸的方法是已知的，具体而言在使用的菌株中通过使用质粒来扩增苏氨酸操纵子(US5,175,107)，或在使用的菌株中通过使用质粒来扩增磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸酶基因(美国专利申请号2002/0110876)。

作为大肠杆菌中涉及L-苏氨酸生物合成的酶的编码基因，已知天冬氨酸激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(aspartate semialdehydedehydrogenase gene)(asd)、天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)和苏氨酸合酶基因(thrC)等。thrA、thrB和thrC(thrABC)构成苏氨酸操纵子。苏氨酸操纵子形成弱化子结构(attenuator structure)，并且其在培养基中的表达受异亮氨酸和苏氨酸抑制。已知将此弱化区的前导序列或弱化子从苏氨酸操纵子去除时，发酵产率得到改进(美国专利号5,538,873，Biotechnology Letters，Vol.24，No.21，November 2002，和国际专利公开WO05/049808)。

迄今为止，已经开发的用于产生L-苏氨酸的方法包括使用：分批培养，其使用初始含有所有营养物的发酵罐；补料分批培养，其使用初始含有预定营养物并且用一种或多种额外营养物进行连续补料的发酵罐(美国专利号5,538,873和欧洲专利号593792)；和调节糖浓度的方法，从而使糖浓度保持在预定水平或更低(国际专利公开WO05/014840和国际专利公开WO05/014843)。此外，已开发的产生L-苏氨酸的其它方法是对培养基进行补料的方法，或向培养基添加营养物的方法，从而将磷酸和碳源作为生长限制因子(美国专利号5,763,230)。

硫是细菌细胞生长的必需因子，并且通常以硫酸铵的形式包含在用于L-苏氨酸发酵的培养基中。然而，就L-苏氨酸的发酵产生而言，在发酵培养基中调节硫浓度和降低硫浓度的作用是未知的。

发明内容

本发明的目的是提供通过使用具有产生L-苏氨酸的能力的埃希氏菌属细菌有效产生L-苏氨酸的方法。

本发明的发明人进行了勤勉地研究从而达到了前述目的。结果，本发明人发现培养基中的硫浓度能够影响发酵结果，并且能够通过调节发酵培养基中的硫浓度以使其保持在预定水平或更低来改进发酵期间L-苏氨酸的产率，并且由此完成本发明。

本发明的目的是提供产生L-苏氨酸的方法，其包括：在含有碳源、氮源和硫源的发酵培养基中培养具有产生L-苏氨酸的能力、属于埃希氏菌属的微生物；和从培养物中收集L-苏氨酸，其中调节所述培养基中的硫浓度以使其处于预定水平或更低。

本发明的又一目的是提供如上所述的方法，其中调节所述发酵培养基中的硫浓度从而使其为0.35g/L或更低。

本发明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述微生物是大肠杆菌。

本发明的又一目的是提供如上所述的方法，其中对所述微生物中的L-苏氨酸生物合成酶进行修饰，从而使该酶不受到L-苏氨酸的反馈抑制。

本发明的又一目的是提供如上所述的方法，其中所述L-苏氨酸生物合成酶选自下组：天冬氨酸激酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶和它们的组合。