[发明专利]用阳离子表面活性剂纯化蛋白质的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2005年4月11日申请的美国临时申请顺序 号60/670,520的优先权，该临时申请的公开内容通过引用结合到本 文中。

发明领域

本申请涉及使用表面活性剂进行蛋白质纯化的领域。

发明背景

生物大分子、尤其是蛋白质的生产，通常包括基于物理 性质和物理化学性质来提高纯度的步骤。在这些工艺步骤中所遇到 的困难包括但不限于能够使可溶性和不溶性分子分离的决定性条 件、在处理步骤后所需分子的回收率相对较低、工艺过程中生物活 性丧失以及蛋白质对工艺步骤条件(例如pH)较敏感。

表面活性剂一直用于生物大分子的处理。阳离子表面活 性剂是公认的一类表面活性剂，它包括两亲性铵化合物。两亲性铵 化合物包括通式为QN⁺的季铵化合物和通式为RNH₃⁺的烷烃链伯铵 化合物。这两种类型的两亲性铵化合物包括优选具有至少6个碳原 子的长脂族链的长链铵表面活性剂(Scott(1960)Methods Biochem. Anal.8：145-197，该文献的内容通过引用全部结合到本文中)。已知长 链季铵表面活性剂与生物大分子发生相互作用。长链季铵化合物在 氮上具有至少1个取代基，取代基由6-20个碳原子的直链烷基链组 成。这类化合物最著名的代表为烷基二甲基苄基铵盐(苯扎铵盐， benzalkonium salt)(氯化烷基二甲基苄基铵(苯扎氯铵)和溴化烷基二甲 基苄基铵(苯扎溴铵))、氯化十六烷基吡啶醋酸地喹铵 (hexadecylpyridinium chloride dequalinium acetate)、溴化十六烷基二甲 基铵(CTAB)、氯化十六烷基吡啶(CPCl)和氯化异辛基苯氧基乙氧 基乙基苄基二甲基铵(苄索氯铵，benzethonium chloride)。季铵表面活 性剂包括盐，例如十六烷基吡比啶盐(例如氯化十六烷基吡啶(CPC))、硬脂酰胺-甲基吡啶盐、月桂基吡啶盐、十六烷基喹啉 盐、月桂基氨基丙酸甲酯盐、月桂基氨基丙酸金属盐、月桂基二 甲基甜菜碱硬脂基二甲基甜菜碱、月桂基二羟乙基甜菜碱和苄索铵 盐(benzethonium salt)。烷基吡啶盐包括硬脂基-三甲基铵盐、氯化 烷基-二甲基苄基-铵和氯化二氯-苄基二甲基-烷基铵。

阳离子表面活性剂用于生物大分子纯化的已知用途包括1) 聚集体(包括蛋白质聚集体)的增溶；2)结合色谱柱的生物大分子的洗 脱；和3)聚阴离子的沉淀，聚阴离子例如透明质酸(HA)、核酸和肝 素(以及与聚阴离子共沉淀的分子)。

阳离子表面活性剂一直用于使蛋白质聚集体增溶。Otta 和Bertini证实，可以用季铵表面活性剂Hyamine 2389使啮齿动物肝 过氧化物酶体的活性尿酸氧化酶增溶(Otta和Bertini(1975)Acta Physiol.Latinoam.25：451-457，该文献的内容通过引用全部结合到本 文中)。曾经发现铵表面活性剂浓度的增加会导致尿酸氧化酶(基于酶 活性)和总蛋白的溶解都增加，相对于蛋白质总量，尿酸氧化酶蛋白 的相对含量却没有增加。换句话说，用阳离子表面活性剂进行增溶 时，尿酸氧化酶蛋白相对于总的蛋白质没有选择性增溶，尿酸氧化 酶蛋白不占总蛋白质的较高百分比。因此，在这个方法中，作为季 铵表面活性剂增溶的结果，相对于蛋白质总量，尿酸氧化酶的纯度 并没有明显提高。

在另一项研究中，Truscoe研究了一组阳离子去污剂、阴 离子去污剂和中性去污剂对牛肾粉尿酸氧化酶的提取功效，发现随 着浓度增加，中性去污剂和阴离子去污剂可提高可溶性尿酸氧化酶 活性，阳离子去污剂(例如季铵盐)则降低总酶活性(Truscoe(1967) Enzymologia 33：119-32，该文献的内容通过引用全部结合到本文中)。 作者得出的结论是阳离子去污剂不能用于纯化牛肾尿酸氧化酶。