[发明专利]通过干扰SR蛋白的结合以及干扰RNA二级结构调节前mRNA中的外显子识别

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和医药领域。更确切地，本发明涉及由前mRNA(前信使RNA)产生的mRNA的重建及应用其的治疗。

背景技术

生物学的中心法则是遗传信息存在于细胞的DNA中并在这个信息的转录上得到表达，其中在产生编码的蛋白质后紧跟着细胞的翻译机制。这种遗传信息流动的观点已经促进了基于类似干扰细胞蛋白质含量的主要的DNA。这种观点正在慢慢改变，取而代之的是追求在DNA水平上进行干扰。

在高等真核生物中，细胞的DNA中的蛋白质遗传信息是在外显子中编码，该外显子通过内含子序列被彼此分开。在一些情况下，这些内含子非常长。转录机制产生同时含有外显子和内含子的前mRNA，而剪接机制，通常在前mRNA产生的过程中已经通过将存在于前mRNA中的外显子拼接在一起从而产生蛋白质的有效编码区。

发明内容

虽然关于由前mRNA产生mRNA相关的实际过程很多都是已知的，仍有大量的是未知的。在本发明中，已经显示了影响剪接过程从而产生不同的mRNA是可能的。该过程允许通过剪接机制产生的mRNA的可预测性和可重复性重构。可以在通常包括在成熟mRNA中的外显子位置与前mRNA杂交的寡核苷酸可以引导这样的靶外显子或该靶外显子的一部分被排除(还被称为外显子跳跃)。

本发明提供了用于确认适合外显子跳跃过程的寡核苷酸的筛选过程的代替方法。本发明还提供了在其它寡核苷酸中可以跳跃之前不能被跳跃的外显子的寡核苷酸。我们之前已经确认了37个外显子内反义寡核苷酸(AON)以诱导人类对照肌管培养中的14个杜氏型肌营养不良症(DMD)的跳跃。本文中我们展示了可以用来诱导总共35种外显子的跳跃的新型AON。

在我们的WO2004/083432的专利申请中，已经披露了产生寡核苷酸的方法，该方法包含由外显子的RNA(预测的)二级结构确定具有可与所述RNA的其它部分进行杂交的结构的区域(闭合结构)以及不能与所述结构杂交的区域(打开结构)，并随后产生寡核苷酸，该寡核苷酸至少部分与所述的闭合结构互补并且至少部分与所述的打开结构互补。

现在我们公开了设计和产生寡核苷酸的代替方法，该方法可以可选地与WO2004/083432的方法进行结合。

在实验部分，我们公开了引起外显子跳跃的外显子内反义寡核苷酸(AONs)的功效和在所述AON的靶前mRNA的位点中的预测SR结合位点的存在(例如通过ESEfinder)之间存在相关性。因此，我们在本文中指出了产生包含确定SR(丝氨酸-精氨酸，Ser-Arg)蛋白在外显子RNA中的(假定)结合位点以及产生互补于所述RNA并且至少部分与所述(假定)结合位点重叠的寡核苷酸的替代方法。术语“至少部分重叠”在本文中被定义为包含SR结合位点的单一核苷酸的重叠、所述结合位点多核苷酸的重叠以及所述结合位点的完全重合。在本发明的一个优选的具体实施方式中，还包含由所述RNA的二级结构确定可以与所述RNA其它部分杂交的区域(闭合结构)以及与所述结构不能杂交的区域(打开结构)，以及随后产生至少能和所述(假定)结合位点部分重叠并且至少能和所述封闭结构部分重叠并且至少能和所述开放结构部分重叠的寡核苷酸。这样，我们提高了获得能够干扰由前mRNA到mRNA的外显子内含物(exon inclusion)的寡核苷酸的机会。第一个选择的SR-结合区域不具备所要求的打开-闭合结构是可能的，在这种情况下选择另外一个(第二)SR蛋白结合位点，随后检测打开-闭合结构的存在。这个过程一直持续到含有SR蛋白结合位点以及(部分重叠)打开-闭合结构的序列被确定。随后，该序列被用于设计与所述序列互补的寡核苷酸。

这样产生寡核苷酸的方法也可以通过颠倒所述顺序来进行，即首先产生包含由外显子RNA的二级结构确定的具有可以与所述RNA的其它部分杂交的区域(闭合结构)和与所述结构不能杂交的区域(打开结构)的寡核苷酸；随后产生的寡核苷酸至少部分与所述闭合结构互补并且其中至少所述寡核苷酸的其它部分能与所述的打开结构互补。在此之后为决定SR蛋白结合位点是否至少与所述的打开/关闭结构重叠。这样就对WO2004/083432中的方法进行了改良。在另外一个具体实施方式中，同时进行选择。