[发明专利]蝶酸及其缀合物的合成和纯化

说明书

相关申请的交叉参考

本申请依照35 U.S.C.§119(e)要求2005年3月16日提交的美国临时申请系列号60/662,277的权益，该申请的公开内容结合到本发明中作为参考。

技术领域

本发明涉及蝶酸和蝶酸衍生物的纯化，以及涉及与其它化合物缀合的蝶酸和蝶酸的类似物和衍生物的纯化。本发明还涉及制备与其它化合物缀合的蝶酸和蝶酸的类似物和衍生物的方法。本发明还涉及用与其它化合物缀合的蝶酸和蝶酸的类似物和衍生物治疗患者的方法。

背景

蝶酸是制备叶酸酯衍生物的一种常规原料，可将其与药物结合以用作治疗上的缀合物(conjugates)，所述缀合物包括以维生素受体为基础的靶标作用缀合物。维生素-药物缀合物可被靶向作用于例如独特表达、过度表达或优先表达维生素受体的癌细胞。例如，一直使用蝶酸作为制备一种缀合物的原料，所述缀合物包含一种通过γ羧基连接的亚乙基二胺桥连接于荧光素的叶酸衍生物。这种缀合物在美国专利申请序列号09/822,379中描述，该专利公开内容结合到本发明中作为参考。所述缀合物被用于以荧光素标记病原性细胞(如癌细胞)，使癌细胞为抗原性的，以使其能被宿主免疫系统识别和清除。

蝶酸可通过各种常规方法制备，所述方法包括合成、叶酸的微生物降解、叶酸的酶降解、叶酸的水解以及其它常规方法。一般来说，通过这些方法制备的蝶酸通常可被相当量的叶酸污染。例如，经酶降解制备的蝶酸可含有25％的叶酸。因此，需要有效的方法除去叶酸污染物以及源于蝶酸制备的其它杂质。

可使用合成方法制备维生素-药物缀合物，包括蝶酸的缀合物。在某些情况下，那些合成方法还可以导致副产物、杂质或其它污染物的形成。因此，需要合成和/或纯化方法来避免形成这些副产物、杂质或其它污染物，或者除去这些副产物、杂质或源于维生素-药物缀合物的其它污染物。

发明概述

本发明描述纯化蝶酸、蝶酸衍生物及其组合的方法。在通过层析法纯化蝶酸、蝶酸衍生物及其组合的一个示例性实施方案中，本发明所述的方法包括以下步骤：(a)使包含蝶酸、蝶酸衍生物或其组合的溶液与离子交换层析载体(support)接触；(b)用pH约为10或10以上的流动相洗脱包含蝶酸、蝶酸衍生物或其组合的第一种流分(fraction)；(c)将第一种流分的pH降低至约3或3以下；以及(d)沉淀蝶酸、蝶酸衍生物或其组合。

在通过层析法纯化蝶酸、蝶酸衍生物及其组合的另一示例性实施方案中，本发明所述的方法包括以下步骤：(a)使包含蝶酸、蝶酸衍生物或其组合的溶液与阴离子交换层析载体接触；和(b)洗脱包含蝶酸、蝶酸衍生物或其组合的第一种流分。

本发明所述的方法还可任选包括洗脱包含叶酸、叶酸衍生物或其组合的第二种流分的步骤(e)，其中第一种流分和第二种流分基本分离。实际的分离包括通过时间、通过预定的流分数目或者其它定量或定性的判定而确定的分离，其表明在第一和第二种流分洗脱期间，第一和第二种流分基本上不重叠。

本发明所述层析方法中的层析载体包括但不限于离子交换树脂、阴离子交换树脂、糖基树脂、糖基离子交换树脂、糖基阴离子交换树脂等。本发明所述层析方法中的流动相包括但不限于具有pH约为10或10以上、约11或11以上或者具有pH范围为约11-13的水相。在一示例性变化方面，流动相不含或基本不含氨或其盐。本发明所述层析方法中的流动相还可任选包括有机共溶剂，如丙酮、四氢呋喃、乙腈、醇类(包括MeOH、EtOH等)以及其它溶剂等。

在另一示例性实施方案中，描述纯化包含蝶酸或其衍生物和荧光素或其衍生物的缀合物的方法。在一方面，那些方法包括以下步骤：(a)使包含所述缀合物的溶液与第一种反相层析载体接触；(b)用流动相洗脱包含所述缀合物的磷酸盐复合物(complex)的第一种流分，该流动相包含磷酸盐，且pH范围约为6-8；(c)使第一种流分与第二种反相层析载体接触；以及(d)用含水的流动相洗脱包含所述缀合物的第二种流分，其中所述第二种流分基本上无磷酸盐。

本发明所述层析方法中的层析载体包括但不限于反相树脂，如C8树脂、C18树脂、其封端变体(capped versions)等。本发明所述层析方法中的流动相包括但不限于水相，其具有的pH为近中性或者稍微中性以上，包括pH范围约7.1-7.7，如pH约为7.4。在一示例性的变化方面，流动相包括一或多种磷酸盐。在另一示例性的变化方面，流动相不含或基本不含磷酸盐。本发明所述层析方法中的流动相还可任选包括有机共溶剂，如MeOH、EtOH、丙酮、四氢呋喃、乙腈等。