[发明专利]通过在释放胞内酶前灭活胞外酶来鉴别样品中的细胞

说明书

所有此处引用的文献全文引入作为参考。

技术领域

本发明属于细胞分析领域，尤其属于临床诊断微生物学。

背景技术

临床微生物学经常涉及检测体液中的细菌。除了包含细菌，这些体液还可能包含患者自身的细胞。宿主和病原体细胞的相对比例变化很大，例如尿样可以包含许多细菌(＞100,000每ml)而几乎不含宿主细胞，而血液样品可以包含过量(10⁷或者等多)宿主细胞。

尽管一些诊断性检验可以轻易区分宿主细胞与细菌细胞(例如革兰氏染色，PCR)，其他则不能。例如，一些诊断性检验依赖的标记物也存在于宿主细胞中，因此两种细胞的存在会干扰检验。这类干扰发现于龈沟液(GCF)检测中。已经认为在病态的GCF样品中，蛋白例如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和乳酸脱氢酶被发现升高，但是所有这些酶可能来自宿主或者细菌[1]。

对于必须在较大宿主细胞背景下鉴定细菌细胞的情况，而且使用非特异的胞内标记物，就需要一种从宿主背景区分细菌标记物的方法。更特别的，当临床血液样品中关注的标记物来自血细胞、细菌细胞甚至血清，需要在它们之间鉴别其不同来源。

本发明的描述

发明人已经发现一种特定检测样品中胞内微生物标记物的方法，即使样品还包含宿主细胞和/或游离溶液中的标记物。通过采用差异细胞裂解方法，裂解宿主细胞但保留完整的微生物，释放宿主细胞标记物，然后灭活大量溶液中的标记物。在来自宿主细胞和溶液的标记物被灭活之后，微生物裂解释放标记物，就可以不受干扰的进行检测。这种技术不仅可用于宿主细胞背景中的微生物，还可用于任何细胞类型的混合物，其中细胞可进行差异裂解。

因此本发明提供一种检测液体样品中关注的细胞存在与否的方法，其中：

(a)样品：(i)包括胞外介质，所述介质包含具有可测活性的酶；和(ii)被怀疑包含关注的细胞，所述细胞包含具有所述可测活性的胞内酶；

(b)所述方法包括以下步骤：(i)用试剂处理液体样品，所述试剂灭活胞外介质中的所述可测活性，但不灭活所述关注细胞中的可测活性；(ii)裂解所述关注的细胞释放胞内酶；和(iii)检测所述可测活性。

在步骤(iii)中检测到可测活性表明关注的细胞存在于样品中；相反，可测活性的缺失表明细胞是不存在的。

在灭活胞外活性之后，但在(b)的步骤(ii)裂解之前，可以培养关注的细胞让其生长。

在一个典型实施方案中，本发明的方法涉及用蛋白酶处理由选择性裂解产生的组合物(例如血液样品，其中血细胞已经被裂解但微生物保存完整)，所述蛋白酶能够消化可测的酶。例如，人腺苷酸激酶(AK)已经被确定对胰蛋白酶处理敏感，因此血液中的背景AK活性可以在微生物裂解前被消除，然后微生物自己的AK活性可以不受血液AK干扰的用于检验目的。当发明人发现即使样品开始就包含与血液中相同的过量的活性，所述方法也可以检测微生物的酶活性，该方法是特别有利的。

因此本发明提供一种检测血液样品中微生物存在与否的方法，包括以下步骤：(i)用试剂处理血液样品，所述试剂裂解血液样品中的血细胞，但不裂解血液样品中的任何微生物，从而从所述血细胞中释放腺苷酸激酶；(ii)用蛋白酶处理所述裂解产物以灭活血液样品中的腺苷酸激酶而不灭活微生物中的腺苷酸激酶；(iii)裂解微生物以释放腺苷酸激酶；和(iv)检测微生物释放的腺苷酸激酶活性。在步骤(ii)和(iii)之间，可以培养一些或者全部的微生物使其生长，并且可进行可能效的抗微生物处理。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括蛋白酶，和下列试剂中至少一种(例如1，2，3，4，5，6，7种)：ADP；二价金属阳离子的可溶性盐；荧光素酶；荧光素；皂角苷；消泡剂；和/或抗凝血剂。二价金属阳离子优选Zn⁺⁺或者Mg⁺⁺。消泡剂优选聚丙二醇。抗凝血剂优选polyanetholsulphonate。皂角苷是优选的成分。试剂盒优选包括以下所有试剂：ADP；二价金属阳离子的可溶性盐；荧光素酶；和荧光素。

本发明还提供一种包含裂解试剂和蛋白酶的反应容器。所述容器通常是一次性的管，并且适合于接收血液样品进行一步法血液裂解和腺苷酸激酶灭活步骤。本发明此外提供还包括血细胞(通常是裂解的)的反应容器。

可测的酶活性