[发明专利]反转探针及其用于核酸检测的用途

说明书

相关申请

本申请要求2005年5月3日递交的美国专利申请No.60/677,056的利益和优先权，其整体公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明一般地涉及探针及其在检测试验中的用途，更具体地，本发明涉及反转探针及其在检测试验中的用途。

背景技术

寡核苷酸探针已在多种不同的体内和体外诊断试验中使用多年并用作研究工具。在试验中，所述探针已被用作例如感兴趣的寡核苷酸序列连接可检测标签(例如酶、荧光团、放射性标签或其他报告基团)的检测剂。另外，寡核苷酸探针可附着在载体(例如颗粒或固体表面)上用于捕获和/或拣选核酸的目的。另外，寡核苷酸探针可被用作扩增、连接或其他酶催化的反应的引物或调节物。

诊断试验(例如用于检测测试样品中靶核酸存在与否的诊断试验)典型地分为一个或两个通用类型。在一个类型中，靶核酸被直接或间接地扩增产生靶标或靶标代用品的拷贝，其均可通过任何方法检测。靶标扩增方法的实例包括聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、滚环扩增(RCA)和连接酶链式反应(LCR)及其他。在另一类型中，靶核酸序列不被扩增。更精确地，靶标被直接检测，典型地使用一种或多种杂交探针。这种类型的试验存在许多形式，其包括例如直接(共价地)标记的杂交探针，或用报告基团或以一些方式可被检测的固相(如珠)间接标记的杂交探针。

一般地，其中靶标被扩增(例如通过PCR)的试验被认为比直接检测试验既更特异又更灵敏。然而，直接试验通常被认为更易于操作，经常不需要复杂的仪器。尽管简单性使得直接试验更吸引人，但是存在改进它们灵敏性的需要。直接试验的灵敏性可能受到限制，因为每个互补的靶核酸仅与单一的经标记的探针结合。已经使用多种途径解决该限制，所述途径包括例如使用多种探针“涂布”靶标，使用含有多个报告基团的支链的探针或接头延伸的探针，或构建含有大量报告子的大“圣诞树”探针(例如可得自Chiron Corporation的Urdea b-DNA试验)。

一种吸引人的途径是使靶核酸(例如DNA或RNA分子)“反转”互补探针或与靶标结合的探针。在这种类型的试验中，探针反转或转化与检测体系连接。文献已报导构建这类体系的尝试。

例如Abe et al.(J.Am.Chem.Soc.(2004)126：13980-13986)描述一种途径，其中探针反转导致24小时内信号的92倍扩增。如Abe等所述，当两个相邻探针被化学或酶连接时可能遇到的一个问题在于被连接的复合物常常比起始复合物更加稳定，导致“产物抑制”。实质上，连接事件使得更难完成探针反转。尽管Abe等试图通过选择性地使连接产物失稳定(通过向两个探针之间引入若干个原子长度的弹性接头从而中断与靶标上相邻位置互补的两个互补半区段)而解决该问题。认为该种类型的复合物比不上两个半探针之间具有直接的键。然而就将该体系用于检测生物学重要靶标的观点看来，Abe等报导的92倍扩增可能不足以造成显著的改进。该途径或其他途径用于商业可能要求30分钟内1000倍或更大的反转。

Fong等(J.Clin.Microbiol.(2000)38：2525-2529)描述了基于“循环探针技术”(CBT)的试验，其包括酶调节的反转体系。在该试验中，当感兴趣的样品中存在靶标时，含有位于中央的核糖核苷酸键的混合DNA-RNA-DNA探针与互补的靶序列杂交。RNA酶H被添加后识别所产生的杂交物并切割双链体的RNA部分。结果探针被切割，产生的被切割的复合物解离，因为其比起始的杂交物不稳定。然后靶序列自由结合另一DNA-RNA-DNA探针分子，该循环重复。置于被切割探针片段末端的标签可以被捕获和/或直接检测。

Dirks等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2004)101：15275-15278)描述了“杂交链反应”，其中以如下方式合成两个发夹(hairpin)探针：它们以重叠(交错)的方式彼此互补。结果它们彼此杂交产生长双链体DNA。这些发夹首次混合时形成双链体的速度非常小，因为发夹中的序列限于双链体构象中，所述构象使得它们不能彼此结合。添加触发分子(即靶序列)后，触发分子与发夹之一粘末端的杂交引起发夹打开。打开的发夹随后打开另一发夹，依此类推，直到所有的发夹被消耗。因此，在加入触发物之前，所述体系实质上含有高度势能，其通过特异触发序列的添加被释放。