[发明专利]生产治疗性蛋白的多步法

说明书

发明背景

1.发明领域。

本申请涉及治疗性蛋白的生产，更具体地说是涉及在其中进行生产过程的器皿。

2.相关领域介绍

DNA技术涉及多个步骤，包括遗传改变细胞系的形成、发酵或培养细胞系以表达蛋白，其包括营养培养基的制备、蛋白的提纯、其包括蛋白分离溶液的制备、和蛋白的制剂及储存。在一或多个生产步骤中任何包含蛋白的溶液中存在污染物，都会使蛋白经受不希望的改变，甚至变性。为了工业操作，用于实施方法中各步骤的器皿主要是不锈钢的，认为不锈钢是耐腐蚀的并因此对存在于生产各步骤中的不同介质无污染。然而，由于使用不锈钢，生产线不得不被定期停产以清洁操作部位(在各产品批次之间)以及进行腐蚀修补。当不锈钢器皿显示出腐蚀作用，例如“变红”或在器皿内表面有锈斑时，其表明所述器皿已经成为导致器皿内所含介质污染的原因。清洁过程是昂贵的，其包括下述步骤如器皿的清理、其内表面的电解抛光、所得表面的灭菌、和对再-磨光器皿是否可以重新使用的验证。停产所导致的生产损失和可能地治疗性蛋白的损失也是高代价的。

关于如何为用于生产治疗性蛋白的器皿提供一种无污染的表面，从而避免对定期停产和清洁的需要和费用，以及避免污染带来的治疗性蛋白的损失的问题仍然存在。

发明简介

本发明通过提供了一种构成器皿的新材料而解决了上述问题，所述器皿是用于治疗性蛋白生产的，其还是无污染的并且不需要清洁。更具体地说，问题是通过本发明的治疗性蛋白的制备方法而得到解决的，其包括(a)制备营养培养基以用于发酵或培养表达所述蛋白的细胞。(b)在所述营养培养基的存在下发酵或培养所述细胞以表达所述蛋白，(c)制备蛋白分离溶液用于分离所述蛋白，(d)制剂分离的蛋白，和(e)储存制剂化的蛋白，步骤(a)-(e)中的至少三步是在单独的由软质薄膜制成的一次性容器中进行的，至少所述容器的所述表面的内侧是含氟聚合物的。薄膜的柔韧性赋予容器以柔韧性，其提高了将容器包装起来以用于在方法的特定步骤中安装所述容器，以及在达到它们的寿命时在工序中除去所述容器从而用另一个由相同薄膜制成的容器进行替换的能力。一次性特定消除了对清洁和灭菌验证的需要并且缩短了替换容器的停产时间。在生产步骤中使用一次性容器的另一个好处是不存在交叉污染，即，在生产过程中由一个器皿给用于随后步骤的器皿所带来的污染转移。

在优选的实施方案中，至少步骤(a)、(b)和(c)是在所述一次性容器中进行的，更优选地，所述步骤(a)-(e)全部在所述一次性容器中进行。在另一个优选的实施方案中，每个容器都完全由含氟聚合物制成。

根据本发明的发生在治疗性蛋白表达过程中的细胞培养因用以表达蛋白的细胞系的不同而不同，上述细胞培养不同于仅涉及原始细胞生长而没有生成不同细胞产品的细胞培养。在后的细胞培养的代表是例如美国专利4,847,462中的一次性袋子的免疫应用。相反，发生在本发明表达过程中的细胞培养从活的、生长的细胞培养物中产生了无生命的蛋白。该蛋白产品比宿主细胞培养物更容易受到来自有机物污染的损害。宿主细胞培养物是活性有机体，因此可以为抵消这样的污染作出一些调整。表达的蛋白，因为其不是活性有机体，所以不能进行这种调节。因此，有机(蛋白)反应的有机物(污染物)对蛋白产生不利影响的可能性要大得多。此外，治疗性蛋白是细胞培养物的一小部分，蛋白在所述细胞培养物中得到了表达。因此，相对于细胞培养物来说可能是很小的有机污染量，相对于治疗性蛋白的量来说将会是很大的量。另一个与单纯的细胞培养的差别是表达过程通常是在一连串的体积增大的反应器中进行的，在每个所述反应器的内部进行细胞培养直到达到最佳密度。所以，细胞培养物/表达治疗性蛋白培养基要预先暴露于从一个生物反应器到下一个生物反应器的众多的生物反应器表面，因此其要遭受每个反应器表面的污染而不是象在单纯的细胞培养中那样仅暴露于唯一的一个容器表面，即不会伴随有不同产品的表达。对从含氟聚合物中浸出有机物的令人惊奇的抵抗力，其中所述含氟聚合物至少形成了在其中进行本发明表达过程的容器(生物反应器)的内表面，使得能够将治疗性蛋白保存为如形成时的那样以用于提供给从产生所述蛋白的生物质内部回收该蛋白的步骤。如下文将进一步描述的，当在将容器用作生物反应器之前通过暴露于降解的电离辐射，例如通过伽马辐射对容器进行了灭菌时，上述抵抗力是特别令人惊奇的。