[发明专利]具有可切割连接物的单链抗体

权利要求书

1.一种制造抗体的方法，所述方法包括：

培养经过编码融合蛋白的核酸转化的真菌细胞，所述融合蛋白从N-端至C-端依次包含：(a)信号序列，(b)含有可变区和恒定区的第一免疫球蛋白链，(c)含有可被蛋白酶切割的蛋白水解切割位点的间隔肽，所述蛋白酶是独立于所述融合蛋白的分子，以及(d)含有可变区和恒定区的第二免疫球蛋白链；其中，所述第一免疫球蛋白链是轻链，而第二免疫球蛋白链是重链，或者反过来；所述融合蛋白在所述间隔肽和所述第二免疫球蛋白链之间没有第二信号序列；并且所述间隔肽没有自加工切割位点；

其中所述融合蛋白被表达，在信号序列的C-端末端被切割以移除所述信号序列，并在所述间隔肽的蛋白水解位点被蛋白酶切割；以及

制造了含有分子间结合的免疫球蛋白重链和轻链对的抗体。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体是包含两对分子间结合的免疫球蛋白重链和轻链的四聚抗体。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述第一免疫球蛋白链是轻链而第二免疫球蛋白链是重链。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述第一免疫球蛋白链是重链而第二免疫球蛋白链是轻链。

5.如权利要求2所述的方法，其中在所述蛋白水解位点发生切割之前，所述融合蛋白的轻链和重链通过分子内键合而相互结合，两个融合蛋白拷贝通过其各自重链恒定区的分子间键合而相互结合。

6.如权利要求2所述的方法，其中在所述蛋白水解位点发生切割之后，所述免疫球蛋白重链和轻链发生分子间结合以形成所述分子间结合的重链和轻链对，并在两对分子间结合的重链和轻链之间发生分子间结合形成所述四聚体抗体。

7.如权利要求2所述的方法，其中所述间隔肽含有可被第一和第二蛋白酶切割的第一和第二蛋白水解位点，两种蛋白酶是独立于所述融合蛋白的分子，其中所述第一和第二蛋白水解切割位点被连接肽所分隔，并且所述第一和第二蛋白酶对所述蛋白水解切割位点的切割从所述融合蛋白中移除了所述连接肽。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述第一和第二蛋白酶是相同的蛋白酶。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述第一和第二蛋白水解位点的切割在细胞内发生。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述细胞分泌所述抗体。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述细胞经过编码切割所述第一和第二蛋白水解位点的蛋白酶的核酸的转化。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述核酸编码第二融合蛋白，所述第二融合蛋白含有与所述蛋白酶融合的第二信号序列，其中所述第二信号序列使所述蛋白酶被摄取进入内质网。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白从细胞中分泌而不包含信号序列，并且所述方法进一步包括使用在间隔肽的蛋白水解位点进行切割的蛋白酶处理所述分泌的融合蛋白。

14.如权利要求1所述的方法，进一步包括从所述细胞中或者从培养细胞的培养基中回收所述抗体。

15.如权利要求14所述的方法，进一步包括纯化所述抗体至基本同质。

16.如权利要求15所述的方法，进一步包括在药物组合物中将所述抗体与可药用载体相结合。

17.如权利要求1所述的方法，进一步包括将编码所述融合蛋白的核酸引入细胞。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是丝状真菌细胞。

19.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是酵母细胞。