[发明专利]通过PH操作将污染物与肺炎链球菌多糖分离

说明书

技术领域

本发明涉及从用于生产肺炎球菌多糖(pneumococcal polysaccharide)的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae)血清型的细胞溶解产物中去除过量可溶性蛋白质的方法。

背景技术

用于疫苗产品的各肺炎链球菌血清型的荚膜多糖通过使有机体在复杂液体培养基中生长产生。有机体群体通常从菌种小瓶到菌种瓶按比例增加且经由一个或一个以上具有递增体积的菌种发酵罐传代直到达到生产规模发酵体积。生长周期的终点可通过数种方法中的一种确定，此时通过添加有助于细胞壁分解和在细胞达到稳定期时引起细胞溶解的自溶素(autolysin)释放的洗涤剂使细胞溶解。然后，收集溶解产物肉汤用于下游(纯化)加工。所述纯化包括数个管柱色谱和渗滤步骤以回收包围细菌细胞的荚膜多糖。当将多糖与诸如CRM₁₉₇的高分子量蛋白质接合且调配为含有具有多种血清型的接合物的疫苗时，在将其注射入诸如婴儿和幼儿的目标群体时，其有助于给予免疫性(对肺炎链球菌)。

已设定各血清型的纯化多糖中蛋白质含量的规格以降低因疫苗导致的不利结果的危险。举例来说，在当前销售的7价肺炎球菌接合物(7vPnC)疫苗(Prevnar)中，纯化血清型4多糖中蛋白质含量的规格为以干重计不大于3％且纯化血清型6B多糖中蛋白质含量的规格为以干重计不大于2％。

在一些情况下，已证明难以移除在整个纯化过程后仍存在的残余蛋白质。通过改变细胞溶解产物的纯化过程解决这一问题所做的努力仅获得中等成果。

因此，决定在这一过程的上游侧着手解决这一问题。确定主要污染蛋白质为细胞生长和完整性的关键。因此，可用于降低总蛋白质的剩余选择由改变生长和/或收集条件组成。

发酵过程相当简单。将细胞(菌种)在具有大豆基培养基的瓶中扩大，然后经由一或两个菌种发酵罐传代，且最终传代至生产规模发酵罐中。在各步骤中，严密监测温度和pH值，其中pH值通过添加碱性物质(20％碳酸钠)加以控制。当生长达到某一点时，通过引入启始细胞溶解过程的诸如脱氧胆酸钠(DOC)的洗涤剂结束操作。一段保持时间后，将溶解产物肉汤的pH值调节到6.6以使脱氧胆酸盐和细胞膜复合物沉淀。将这一物质保持直到可通过离心和过滤加工以移除固体。

然而，大量蛋白质仍溶解于澄清溶解产物中，从而使得纯化多糖中的残余蛋白质含量超出规格。因此，对在发酵或纯化过程中降低数种肺炎球菌血清型中的可溶性蛋白质含量存在需要。

发明内容

本发明通过提供一种在纯化之前降低复杂细胞肺炎链球菌溶解产物肉汤中的蛋白质含量且保持其中荚膜多糖含量的方法满足这一需要。这一方法包含以下步骤：

(a)使选定肺炎链球菌血清型在大豆基培养基中生长，其包括：

(i)向含有大豆基培养基的第一个容器接种选定血清型的菌种储备物，且培育第一个容器直到生长要求得到满足，和

(ii)向含有大豆基培养基的第二个容器接种来自步骤(i)的培养物，同时在第二个容器中维持稳定的pH值和温度，和

(b)用洗涤剂溶解步骤(a)中所产生的细菌细胞，从而产生含有可溶性蛋白质、细胞碎片、核酸和多糖的溶解产物；

(c)搅拌细胞溶解产物历时足以确保完全溶解和多糖释放的时间；

(d)将细胞溶解产物的pH值降低到小于5.5以使洗涤剂和大部分可溶性蛋白质沉淀析出；

(e)在不搅拌的情况下将步骤(d)中所形成的溶液和沉淀保持历时足以使沉淀沉降的时间；和

(f)通过离心和/或过滤加工溶液和沉淀，由此溶液中的荚膜多糖得以保留且可溶性蛋白质得以有效减少。

选择作为本发明的这一实施例的例示性非限制性肺炎链球菌血清型为1、4、5、6A、6B、7F和19A。在本发明的一特定实施例中且视步骤(a)中所生长的血清型而定，通过氢氧化钠、碳酸钠或其组合的碱馈入维持步骤(a)中的发酵pH值。在另一实施例中，将步骤(d)中的pH值降低到4.5与小于5.5之间。在又一实施例中，洗涤剂为脱氧胆酸钠。

本发明也涉及一种在纯化之前降低复杂细胞肺炎链球菌溶解产物肉汤中的蛋白质含量且保持其中荚膜多糖含量的方法。这一方法包含以下步骤：

(a)在大豆基培养基中使选定肺炎链球菌血清型从开始容器到生产规模容器以递增体积扩大且在细胞生长期间维持稳定的pH值和温度；

(b)用洗涤剂溶解步骤(a)中所产生的细菌细胞，从而产生含有可溶性蛋白质、细胞碎片、核酸和多糖的溶解产物；